高血压是导致心血管疾病高死亡率的重要因素,可以通过多种机制导致终末目标组织器官如心脏、脑组织、肾脏、肝脏和血管的损伤,降压治疗可以明显的预防和降低心血管不良事件的发生,所以降压治疗有着重要的意义。高血压各种复杂的病理生理机制有一个共同点就是活性氧的利用度增加,即氧化应激。活性氧在心血管系统中调控血管内皮功能,参与血管内皮炎症、增殖、迁移、凋亡、血管生成等过程。活性氧产生增强,以及抗氧化系统作用功能的减弱,结果可导致血管内皮损伤和功能异常,这是导致与血管内皮作用关系密切的,如高血压、动脉粥样硬化等疾病的重要原因。对于血管内皮细胞损伤的治疗和修复保护,目前有学者将其视为降压治疗的终点,和疾病发展转归的危险预测信号,所以,研究血管内皮细胞的损伤与保护对于疾病预测和疗效观察意义重大。有研究发现抗高血压药物可以导致肾脏、膀胱、心脏、脑和肝脏组织基因表达改变,除了既往明确与心血管疾病有关的基因以外,还包括16种未曾在心血管疾病中发现的基因表达改变,其中包括白介素24(IL-24)基因,组织蛋白酶Z(Cathepsin Z,Ctsz)基因等。这些差异表达基因可能是潜在的生物标志物,以及心血管疾病防治新靶点,可能为该领域相关疾病治疗的发展提供有价值的信息。IL-24基因是近年来发现的一种肿瘤抑制基因,国内外很多研究已经证明它在多种肿瘤生长转移过程中发挥治疗作用。一系列发病分子机制在肿瘤和心血管是共同的,吸烟产生的有毒物质代谢和饮食中脂肪摄入量增加,都可以引起该两种病理过程有关的共同发病分子机理——即氧化应激和细胞损伤。动脉粥样硬化的发病可能源于损伤、感染所致的变异或转换单一的动脉平滑肌细胞的祖增殖克隆,类似于目前最广泛持有的致癌发生理论。细胞增殖相关的调节通路参与动脉粥样斑块进展,脉管的病理性狭窄与癌侵袭进展。细胞间粘附分子性状改变可以参与到斑块和血栓的形成,以及肿瘤扩散转移等病理过程。结合蛋白酶表达的改变可以参与到溶栓治疗,动脉粥样硬化斑块扩张和出血,以及恶性肿瘤的侵袭和转移。鉴于二者发病机制的共同点,一些新型的治疗策略可以同时针对心血管疾病和癌症,即针对心血管疾病和癌症的共同发病分子机制有着类似的治疗策略,主要包括减弱氧化应激损伤、使用抗炎剂减少趋化因子,细胞活素和生长因子的细胞信号、抑制细胞增殖、抗血管生成以延缓动脉硬化和癌症斑块扩张浸润转移、使用放射治疗等方面。考虑IL-24基因的生物学作用涉及到心血管疾病和癌症新型治疗策略的多个方面,我们推测其对高血压等心血管疾病的发病分子机制也有潜在的治疗作用,以及与高血压疾病的发生发展具有密切关系,以及与降压药物治疗具有相关性。在细胞实验部分,我们研究IL-24基因表达是否对氧化应激导致的内皮损伤具有保护作用及作用机制,通过利用脂质体介导外源性导入重组质粒p DC-316-IL-24至体外培养脐静脉内皮细胞(HUVEC),转染后24小时利用荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR检测目的基因表达情况,转染成功后给予不同浓度过氧化氢损伤,利用增殖实验观察IL-24对较低浓度的过氧化氢导致的HUVEC异常增殖的影响作用;较高浓度过氧化氢损伤后,HUVEC细胞存活率的检测利用细胞计数Kit-8(CCK-8)法来进行检测,HUVEC细胞凋亡情况采用Annexin-V/PI联合染色并流式细胞术检测,凋亡相关Cleaved caspase-3的表达采用Western-blot方法检测,流式细胞术及荧光探针标记法测定细胞内活性氧含量,western-blot方法检测PI3K/PKB信号通路蛋白的表达,Real-time PCR和Western-blot检测细胞中高血压疾病相关因子Angiotensinogen(血管紧张素原)、endothelin-1(内皮素-1)、ATRAP(血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白angiotensinⅡtype 1 receptor-associated protein)、PDGF(血小板源性生长因子)RNA和蛋白表达情况。同时,基于IL-24广泛生物学活性的理论基础,我们推论IL-24基因与心血管疾病可能有密切关联,且可能具有治疗潜力。在本研究的动物实验部分,我们研究IL-24表达水平变化与高血压疾病血压升高与降压治疗的关系。我们通过利用血管紧张素II微量渗透泵皮下埋植构建高血压大鼠模型,造模成功后采用Real-time PCR和Western-blot方法检测对照组和高血压模型组IL-24基因表达水平;稳定升压后一周给予高血压模型组大鼠依那普利及硝苯地平降压治疗,血压稳定下降后一周同法检测IL-24基因含量;分析IL-24基因的表达情况与血压升降变化之间的关系。研究结果表明,细胞实验中IL-24可以明显抑制低浓度H2O2导致的细胞异常增殖,降低细胞内ROS含量,下调细胞内活化Caspase-3水平,减少氧化应激所致HUVEC细胞损伤,从而提高细胞存活率,降低细胞早期和晚期凋亡比率,并可以下调H2O2刺激所致高血压发病相关因子的表达,从而减少心血管疾病的发生。IL-24可能通过活化PI3K/PKB信号通路来发挥抗氧化作用,进而影响其下游的如NF-κB、AP-1等信号通路来调节血管内皮功能和心血管疾病并发症的发生。动物实验中高血压模型大鼠器官组织IL-24表达明显下降,降压治疗后表达升高,IL-24与高血压疾病发生发展密切相关。综上所述,IL-24基因可以抑制HUVEC的异常增殖,活化PI3K/PKB信号通路来发挥抗氧化作用,减弱H2O2导致的氧化应激,保护血管内皮细胞抵抗氧化损伤,下调细胞内活化Caspase-3表达,减少细胞凋亡而提高存活率。同时,IL-24可以下调血管损伤后产生增多的与心血管疾病发病有关基因的表达,减少心血管疾病的发生,此外,IL-24可能参与依那普利和硝苯地平降压治疗的分子机制,这些结果表明IL-24基因除了具有抑癌作用,可能对于高血压也具有治疗潜力,或能作为新的治疗高血压的靶点和分子通路中的关键基因,然而,IL-24如何参与降压药物治疗过程的详细机制尚需后续研究中进一步探讨。考虑到癌症和心血管疾病的发病共通性和IL-24对ROS诱导致病过程的抑制作用,IL-24可能为ROS导致的各种心血管疾病提供基本的干预策略。第一部分IL-24基因对过氧化氢导致HUVEC氧化损伤的保护作用和机制研究目的:研究IL-24对H2O2所致HUVEC损伤的影响及作用机制,探讨IL-24与心血管疾病的相关性。方法:人脐静脉内皮细胞株在37℃CO2孵箱内正常培养,贴壁生长状态良好情况下进行实验操作。细胞实验部分分组:Ⅰ空白对照:细胞用高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+青链霉素双抗中正常培养;ⅡH2O2损伤组:该组细胞分别给予0.10,0.30mmol/L作为较低、较高终浓度的H2O2;ⅢH2O2损伤+IL-24预保护组:H2O2损伤浓度同组Ⅱ,在损伤之前先进行转染预保护,将重组质粒p DC316-h IL-24和Lipofectamine 2000 10μl混匀以进行转染,重组质粒p DC316-h IL-24与脂质体比例(μg:μl=1:1);ⅣH2O2损伤+空质粒组:H2O2损伤浓度同组Ⅱ,空质粒p DC316与脂质体比例(μg:μl=1:1);ⅤIL-24组:重组质粒p DC316-h IL-24转染同组Ⅲ;Ⅵ空质粒组:p DC316转染方法同组Ⅳ。转染后24小时基因转染组荧光显微镜观察转染效率,利用RT-PCR方法确定转染成功。利用划痕实验检测IL-24对低浓度H2O2导致的异常增殖的抑制作用,细胞存活率采用CCK-8法检测,活化caspase-3表达采用western-blot方法检测,HUVEC细胞凋亡情况和细胞内ROS水平利用流式细胞术及荧光探针标记法测定,western-blot方法检测PI3K/PKB信号通路蛋白的表达,Real-time PCR和Western-blot法检测细胞内心血管疾病相关因子RNA水平和蛋白表达情况。结果:划痕实验表明IL-24可以明显抑制低浓度H2O2导致的细胞异常增殖,H2O2组与H2O2+IL-24组相比较,两组差异具有统计学意义,P<0.05;IL-24可降低细胞内ROS含量,H2O2损伤组ROS含量明显高于其他组,与对照组和IL-24保护组相比较差异具有统计学意义,P<0.001;IL-24保护细胞对抗氧化损伤,可以明显减少细胞凋亡情况,下调细胞内caspase-3的活化水平,H2O2损伤组和IL-24保护组差异具有统计学意义,P<0.001;H2O2损伤组细胞存活率最低,与对照组相比较差异明显,P<0.001,加入IL-24保护可以明显减少氧化应激引起的细胞损伤死亡,细胞存活率明显提高,H2O2组与H2O2+IL-24组相比较具有明显统计学差异,P<0.05;H2O2损伤引起的氧化应激,刺激PI3K/PKB信号通路活性增强来发挥抗氧化作用,与未干预对照组相比较,PI3K、PKB(Akt)蛋白均表达上调,差异具有统计学意义,P<0.05。IL-24保护组可以显著的提高该信号通路蛋白的表达水平,且与H2O2损伤组相比较差异显著,P<0.001,从而进一步发挥抗氧化作用;IL-24还可下调H2O2刺激导致升高的心血管疾病相关因子Angiotensinogen、endothelin-1、ATRAP、PDGF的的表达,P<0.001。结论:IL-24可以抑制HUVEC的异常增殖,保护细胞对抗氧化损伤和抗细胞凋亡,下调细胞内活化caspase-3蛋白表达水平,提高HUVEC细胞存活率。同时,IL-24可以下调血管损伤后产生增多的与心血管疾病发病有关基因的表达,减少心血管疾病的发生和抑制疾病进展。IL-24可能通过活化PI3K/PKB信号通路来发挥抗氧化作用,进而影响其下游的一些因子或信号通路来调节血管内皮功能和心血管疾病并发症的发生。考虑到癌症和心血管疾病的发病共通性和IL-24对ROS诱导致病过程的抑制作用,IL-24基因可能为ROS导致的各种血管疾病提供基本的治疗策略。第二部分IL-24与高血压疾病发病及治疗相关性的研究目的:探讨IL-24基因与高血压疾病发生发展和药物降压治疗的相关性。方法:正常SD大鼠分为对照组(n=12)和高血压模型组(n=36)。利用血管紧张素II微量渗透泵构建高血压大鼠模型,按照微量渗透泵使用说明和大鼠体重计算微量渗透泵用药量【500 ng/(kg·min)】,手术操作将含药微量渗透泵置于大鼠腹部皮下,无菌缝合,观察大鼠生存情况,每日观察大鼠精神状态及血压升高情况。血压升高后1周处死该组部分大鼠(n=12)和对照组大鼠(n=12),取大鼠心脏和肾脏组织,Real-time PCR和Western-blot检测IL-24基因表达含量的变化。剩余高血压大鼠分为继续高血压组(n=12)和高血压治疗组(n=12)两组,治疗组给予依那普利(剂量35mg/Kg/d)和硝苯地平(剂量30mg/Kg/d)药物治疗,血压稳定下降后处死大鼠,Real-time PCR和Western-blot检测大鼠心脏和肾脏组织IL-24基因表达含量的变化。结果:Real-time PCR和Western-blot检测大鼠高血压造模成功和降压治疗后心脏和肾脏组织中IL-24基因的RNA和蛋白水平。结果表明,高血压造模成功后,大鼠心脏和肾脏组织的IL-24基因表达明显下调,与对照组相比较具有统计学差异,而降压治疗后,IL-24基因表达又会明显升高,与未治疗组比较具有明显差异,P<0.001。Western-blot结果表明,高血压造模成功的大鼠体内IL-24蛋白表达明显减少,与对照组相比较,与β-actin相比,IL-24蛋白相对表达含量分别为(0.95±0.041/1.87±0.062),P<0.001,对照组大鼠与高血压组大鼠相比较差异具有统计学意义。经过降压治疗后,IL-24基因RNA和蛋白表达明显上调,与未治疗组相比较,与β-actin相比,IL-24蛋白相对表达含量分别为(1.54±0.014/0.81±0.042),P<0.001,降压治疗组和未治疗组相比差异具有统计学意义,P<0.001。结论:通过构建高血压模型,证明IL-24基因RNA和蛋白表达与高血压疾病的发生发展具有密切相关性,血压升高后该基因表达下降,降压治疗可出现该基因的表达升高,提示IL-24可能参与依那普利和硝苯地平降压治疗的分子机制,但是IL-24如何参与降压药物治疗过程的详细机制尚需后续研究中进一步探讨。研究结果提示IL-24基因可能对于高血压也具有治疗潜力,或能作为新的治疗高血压的靶点和分子通路中的关键基因。