在我国葡萄生产是农业生产的一个重要组成部分，长期以来，一直受病害的困扰。葡萄病毒病害是继真菌病害的第二大主要病害，如葡萄扇叶病(Grapevine fanleaf virus)、葡萄卷叶病(Grapevine roll leaf virus)全世界葡萄产区均有发生，严重危害葡萄的生长与结果，一般减产25％-30％，严重时达80％，果实品质也严重受损。采用化学防治，不仅费工费时，增加生产成本，而且造成环境污染；传统的抗病育种方法因葡萄遗传背景复杂，生命周期长及抗性基因资源匮乏等而受到极大限制。近年来，分子生物学和植物基因工程技术的迅速发展，为作物的品种改良开辟了一条新途径，用基因工程手段进行品种改良不仅可以有针对性的改变植物性状，而且与常规育种相比，具有投资少、见效快及可以充分利用远缘的基因资源等优点。 本研究利用基因重组技术构建了两个带有天花粉蛋白目的基因的高效植物表达载体pBITCS及pBTC，并以欧洲种葡萄Semillion为试材，采用农杆菌介导法首次将天花粉蛋白基因(TCS)导入葡萄，探讨了植株再生的最佳培养条件、影响转化效率的主要因素及转化体的最佳筛选方式，建立了稳定的遗传转化体系，获得了大量的PCR阳性植株。为进一步探讨TCS基因对葡萄病毒的广谱抗性提供了材料，也为获得更多抗病毒转基因经济作物奠定了理论基础。主要研究结果如下： 1 构建了两个中间载体(pMTCS、pATCS)和两个植物表达载体pBlTCS、pBTC (1) 为了将TCS基因以农杆菌介导法导入葡萄，利用质粒pUTCS、pMM23、pAHC17及pBI121构建了植物表达载体pBITCS，其上含有目的基因TCS及GUS和NPTⅡ基因，经酶切鉴定及PCR扩增证明载体构建正确。 (2) 利用质粒pAHC17、pBI121及中间克隆载体pMTCS构建了植物表达载体pBTC，其上只含有目的基因TCS和NFTⅡ选择标记基因，去除了GUS报告基因，以对比GUS基因对目的基因表达效率的影响。 (3) 植物表达载体上的天花粉蛋白基因由双35S启动子启动，可显著提高目的基因的表达效率。 2 优化了植株再生体系 (1) 体细胞胚萌发的最佳培养基为Nitsch+0.1mg／L6-BA+0.01mg／LNAA。在该培养基中获得的完整植株比率最高为67.5％。 (2) 生根阶段的最佳培养基为Nitsch+0.1mg／LIBA或0.04mg／LNAA。在添加0.1 mg／L IBA的培养基中，植株的平均单株生根数为5.4条，平均根长为3.3cm且无愈伤化苗产生；在添加0.04mg／L NAA的培养基中，平均单株生根数为4.8条，平均根长3.9cm，根的基部也没有愈伤化现象产生。二者的单 硕士学位论文 农杆菌介导法将天花粉蛋白基因导入葡萄的研究 东北衣业大学 株生根数和平均根长均无显著差异，都可作为生根培养基。 （3）生很培养基中添加 1叭活性碳可防止根系褐化，使褐化率降低了87．4％。 3 优化了遗传转化体系 （1）通过3因素3水平正交试验，探讨了侵染受体、共培养时间、共培养基叫 值对遗传转化效率的影响。结果表明，试验组合：预培养的胚性愈伤、共 培养4天、共培养基叫．2为最优试验组合。这与本试验中试验组合8结 果一致，其抗性愈伤比率最高，为 39％。极差分折表明，各因素的主次 顺序为：共培养基叫值＞共培养时间＞侵染受体。本试验中最主要的影响 回素是共培养基pH值。 m 确定了筛选抗生素的种类及浓度。在卡那霉素。G4 18、新霉素二种氨基糖 百类抗生素中，确定出新霉素为最适合选择剂，液体筛选的最佳浓度为 80mMi，固体筛选的最佳浓度为 100mgh。 门）确定了最佳筛选方式。液体、固体相结合的筛选效果好于单纯的固体筛选。 胚性愈伤经过液体筛选5大，d度培养7－10天。再进行固体筛选，直至体细胞 胚产生，这种筛选方法阳性植株率最高，为＆二％。 4 获得了大量转基囚阳性植株 以天花粉蛋白基因两端序列合成的引物，对转化后获得的再生植株进行PCR检 测，结果转pBffCS获得了132株再生植株。拾觎了门 株，有47株呈阳性，阳性植 株比率为398％：转pBTC得到了门6株再生植株，捡测了146株，有13株呈阳性，阳 性植株比率为8．90／。pR检测初步证明，天花粉蛋白基因己整合到葡萄基因组中。