研究背景脑的能量代谢具独有的特点,脑是氧耗量最高的组织,同时也是葡萄糖代谢最旺盛的组织,但糖是脑的主要供能物质,脑赖以产生能量的底物少,储存的能量极少,所以脑细胞能量代谢障碍是缺血性脑损伤首先发生的非常重要的环节。在脑缺血缺氧时,细胞内氧化代谢障碍,只能依靠葡萄糖无氧酵解产生能量,糖降解作用增加数倍,从而产生由丙酮酸还原而来的乳酸,乳酸在脑细胞内堆积造成脑细胞内的酸中毒,导致脑水肿,同时脑细胞的ATP和磷酸肌酸很快减少、耗竭殆尽,使得脑细胞能量来源不足,致使细胞膜离子泵功能受损,脑细胞肿胀,造成神经元损伤、凋亡和死亡。因此,临床上发生心脏骤停、严重休克等可通过影响全脑或局部脑血液循环,使得脑血流的突然减少或停止,大大降低了脑组织氧和糖的供应,引起脑细胞的能量衰竭,可导致神经元严重的缺血、损伤,甚至造成不可逆的脑损伤,尤其是更易损害对缺血敏感的海马,临床表现为神经功能损害、认知功能障碍,如记忆和感觉运动障碍。在美国,每年约有326000门诊患者和209000住院患者发生心脏骤停(cardiac arrest,CA),心脏骤停和复苏会导致短暂性全脑缺血性损伤和缺血再灌注损伤,这种损伤是CA后高致残率、高死亡率的主要因素。然而,尽管全球权威的专业组织定期更新心肺复苏指南,并培训、指导目击者在第一时间内参与复苏,但效果仍然不佳,且发生的脑损伤目前仍缺乏有效的治疗措施,所以发生CA的患者其预后依然很差,据报道,心脏骤停患者中的幸存者能恢复良好的神经功能的不到9%。这严重影响早期复苏成功患者生活质量的同时也给社会带来沉重的经济负担,从而严重危害人类健康。随着社会、科技进步和医学研究的发展,出现了许多治疗神经系统疾病的新药和新方法,虽然也有一些针对急性脑缺血或再灌注后细胞损伤的神经保护剂,但其疗效与安全性仍不确定。全脑缺血性脑损伤和缺血再灌注性脑损伤的发病机制机制仍不清楚,可能的机制有能量代谢障碍、兴奋性氨基酸的神经毒性、细胞内钙超载、氧自由基损伤、一氧化氮(nitric oxide,NO)损伤以及炎症反应、凋亡等,以上各种机制往往互为因果、共同作用,形成损伤级联反应,最终导致神经细胞损伤。其中神经元凋亡是神经元死亡的一种形式,特别是在迟发性神经元死亡中起着非常重要的作用,在缺血性脑损伤早期就出现凋亡细胞并持续几天或几周,且凋亡级联反应的激活可能是通向细胞死亡的最后共同通路,它可引起细胞继发性坏死。另有研究表明,炎症是机体对损伤最重要的宿主反应,神经炎症在全脑缺血性损伤及中枢神经系统的许多疾病中起着关键的作用,大量临床和基础研究均已发现,在脑缺血过程中存在炎性反应,包括小胶质细胞和星形胶质细胞的活化、炎性因子和趋化因子的产生、白细胞和单核细胞浸润,以及黏附分子、补体和金属蛋白酶类表达水平和活性的升高。其中促炎性细胞因子白细胞介素(Interleukin,IL)1 β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18),被认为是特别重要的炎症介质,而工L-1β和IL-18是需要将它们的无活性前体蛋白水解成活性分子后才能发挥作用,这个活化过程的关键酶是IL-1β转化酶,也称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1),因此,caspase-1也被认为是炎症的同义词,然而,除了促进神经炎症外,caspase-1也是一种促凋亡的蛋白酶,有文献报道,caspase-1可直接参与非感染性的细胞死亡过程。既然caspase-1与炎症、凋亡等密切相关,那么caspase-1是否确实通过以上方式及其他方式参与缺血性脑损伤过程,并影响其结果哪?有研究发现,在基因敲除或抑制caspase-1的小鼠,能减轻脑缺血引起的脑损伤,改善缺血后神经功能。因此,caspase-1抑制剂可能在缺血性脑损伤中发挥着一定的神经保护作用。如能证明caspase-1抑制剂治疗缺血性脑损伤的有效性并探索可能机制,有助于为缺血性脑损伤的治疗提供新的线索和潜在的药物靶点,有着重要的医学价值和社会意义。Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族,可以在特定的天冬氨酸残基位点裂解靶蛋白,已经证实几乎caspase家族的每个成员均以不同的形式和机制参与缺血性脑损伤,而caspase-1是caspase家族中非常重要的一员,它是与神经炎症密切相关的酶,是影响许多中枢神经系统相关疾病的关键因素。有趣的是,caspase-1不仅被认为是炎症过程的重要调节因子,而且是细胞凋亡关键的执行者。然而,目前尚不明确,caspase-1抑制剂是否能够调节短暂性全脑缺血导致的细胞凋亡和随之发生的死亡,本研究也关注的是,caspase-1抑制剂经鼻给药是否对短暂性全脑缺血导致的损伤具有保护作用。研究目的1.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型,探索在全脑缺血再灌注后经鼻给予天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂Ⅳ(caspase-1 Inhibitor Ⅳ,Boc-D-CMK;caspase-1抑制剂的一种)是否能减轻全脑缺血再灌注诱导的炎症。2.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型,探索在全脑缺血再灌注后经鼻给予Boc-D-CMK是否能减轻全脑缺血再灌注诱导的凋亡及神经元损伤。3.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型,探索在全脑缺血再灌注后经鼻给予Boc-D-CMK是否对全脑缺血再灌注诱导的功能损害有保护作用。4.利用大鼠四动脉阻断全脑缺血模型,探讨caspase-1参与保护全脑缺血再灌注诱导的神经元损伤的可能机制。研究方法1.清洁级健康SD大鼠6只,雄性,应用生物素标记的caspase-1抑制剂经鼻给药12小时后处死大鼠,利用共聚焦显微镜显像观察生物素标记的caspase-1抑制剂在脑内的分布情况。2.清洁级健康SD大鼠12只,雄性,在大鼠四动脉结扎全脑缺血模型中,采用分光光度比色法检测缺血再灌注后不同时间点caspase-1的活性。3.清洁级健康SD大鼠48只,雄性,随机分为三组：假手术对照组；缺血组；缺血+Boc-D-CMK组(治疗组)。采用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型,应用免疫印迹、免疫组化研究蛋白表达量的变化,采用分光光度计比色法检测酶的活性,采用ELISA的方法检测炎症因子的分泌,利用免疫荧光和激光共聚焦技术观察蛋白的表达、神经元凋亡、神经元存活和线粒体的膜电势,采用焦油紫染色和TUNEL染色研究海马CAI区神经元细胞存活和凋亡,应用巴恩斯迷宫和新物体识别实验判断大鼠的学习记忆、记忆缺失等神经功能损害。研究结果1、成年雄性SD大鼠海马CAI区caspase-1蛋白的表达首先,我们观察了在不进行缺血的假手术大鼠海马CAI区caspase-1蛋白的基础表达。采用免疫荧光染色法检测caspase-1、微管相关蛋白(Microtubule associated protein-2,MAP2)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)显示了caspase-1在大鼠海马CAI区的表达,且结果发现caspase-1在海马CAI区与MAP2和GFAP共染,提示caspase-1在在大鼠脑内神经元和星形胶质细胞中表达。进一步研究发现,在全脑缺血再灌注后第三天和第十四天,caspase-1在海马CAI区星形胶质细胞存在明显的过表达。2、生物素标记的caspase-1抑制剂经鼻给药后在中枢神经的分布应用生物素标记的caspase-1抑制剂经鼻给药12小时后处死大鼠,取脑片常规处理后加入二抗,利用共聚焦显微镜显像观察了生物素标记的caspase-1抑制剂在脑内的分布,结果提示caspase-1抑制剂经鼻给药后可以渗入大鼠脑内,且证实药物可以分布在缺血敏感的海马CAI区,caspase-1抑制剂主要分布在海马和皮层神经元的细胞浆内。3、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以抑制全脑缺血诱导的海马CAI区caspase-1的过表达和caspase-1的活性首先该研究测定了大鼠全脑缺血再灌注后海马CAI区caspase-1活性的时间曲线。研究结果发现,与缺血前相比,在大鼠全脑缺血再灌注后所有时间点caspase-1活性均增加,大鼠全脑缺血再灌注后第3天前后达到高峰,第5天仍维持在较高水平。共聚焦显微镜观察发现经鼻给予Boc-D-CMK可明显抑制大鼠全脑缺血再灌注后第3天海马CAI区活化的caspase-1,且这种活化的caspase-1多在星形胶质细胞内表达。4、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以改善全脑缺血诱导的海马CAI区神经元线粒体功能经鼻给予Boc-D-CMK后处理能逆转全脑缺血诱导的海马CAI区神经元线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化,能明显增加线粒体细胞色素C氧化酶活性,免疫印迹法结果分析进一步表明,Boc-D-CMK能减少全脑缺血诱导的海马CA1区神经元内细胞色素C从线粒体向细胞浆的释放,从而增加细胞色素C在线粒体的含量,可能减轻全脑缺血对神经元线粒体功能的损害。5、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以抑制全脑缺血再灌注诱导的海马CA1区活化的caspase-9和活化的caspase-3的激活共聚焦结果显示,在大鼠全脑缺血再灌注第3天,活化的caspase-9和活化的caspase-3的活性显著增加。通过双重免疫荧光染色研究表明,活化的caspase-9和活化的caspase-3与神经元特异性核蛋白(Peuronal-specific nuclear protein,NeuN)阳性细胞共染,而经鼻给予Boc-D-CMK后处理能明显减少共染的活化的caspase-9及活化的caspase-3的激活。6、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可以抑制全脑缺血再灌注诱导的海马CA1区的凋亡免疫荧光染色显示,在全脑缺血再灌注后第3天,全脑缺血再灌注诱导海马CA1区细胞层TUNEL阳性细胞数和聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(Poly ADP-ribose polymerase, PARP1)阳性细胞数明显增加,而经鼻给予Boc-D-CMK后处理能显著减少TUNEL阳性细胞数和PARP1阳性细胞数的增加。7、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理能减少全脑缺血诱导的海马CA1区小胶质细胞的激活和星形胶质细胞的活化首先,Western blotting检测结果显示,在全脑缺血再灌注后第3天,海马CA1区离子钙接头蛋白抗体(Ionized calcium-binding adaptor molecule-1,Iba1)和GFAP含量与假手术对照组相比明显增加,表明在全脑缺血再灌注早期阶段即诱导胶质细胞增生,而经鼻给予Boc-D-CMK后处理可明显降低Ibal和GFAP的增加。共聚焦显微镜结果提示,在全脑缺血再灌注后第14天,缺血再灌注诱导小胶质细胞和星形胶质细胞激活,经鼻给予Boc-D-CMK后处理可抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活或活化。8、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理可抑制海马CA1区全脑缺血再灌注诱导的炎性细胞因子的产生和减少神经元死亡在全脑缺血再灌注后第3天,海马CA1区炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-a分泌显著增加,经鼻给予Boc-D-CMK后处理明显抑制了海马CA1区炎性细胞因子的产生。通过焦油紫染色、NeuN染色共聚焦显微镜显像进行的组织学评价,证实全脑缺血再灌注可诱导缺血易损的海马CA1区局部神经元死亡,经鼻给予Boc-D-CMK后处理显著增加全脑缺血再灌注后第14天海马CA1区神经元存活数量。9、经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK后处理能改善大鼠全脑缺血再灌注诱导的空间学习记忆能力障碍,能显著增强缺血后大鼠的新物体识别的长程记忆能力。应用巴恩斯迷宫评估大鼠海马依赖的空间学习和记忆能力发现,全脑缺血再灌注后大鼠定位到目标逃离暗箱的时间明显延长,并且在探索阶段测试中,在目标逃离暗箱所在四分之一象限停留的时间缩短,而经鼻给予Boc-D-CMK后处理能改善大鼠空间学习与记忆能力。由于海马的完整性还与如新物体识别记忆能力的非空间的学习记忆能力有关,本研究应用新物体识别试验评估各组大鼠,发现全脑缺血再灌注后的大鼠对新物体的识别指数降低,经鼻给予Boc-D-CMK后处理能改善大鼠新物体识别能力的下降。研究结论1.经鼻给予的Boc-D-CMK能进入中枢神经系统,随后发挥抑制caspase-1的活性,降低神经元线粒体的功能损害,抑制缺血易损的海马CA1区活化的caspase-3、活化的caspase-9和凋亡,能增加神经元的存活数量。2.经鼻给予的Boc-D-CMK改善大鼠全脑缺血导致的学习记忆障碍、长程识别能力下降。3.进一步的研究表明,经鼻给予Boc-D-CMK发挥神经保护作用的可能机制如下：抑制过度胶质活化、抑制下游促炎因子减轻神经炎症的反应、显著增加海马CA1区NeuN-阳性细胞数而减少TUNEL-阳性细胞数和PARP1-阳性细胞数。总之,本研究表明,经鼻给予caspase-1抑制剂Boc-D-CMK能通过调节抗炎和抗凋亡的作用以减少大鼠全脑缺血后海马CA1区的神经细胞死亡,使其功能损害得以改善。该研究提示,抑制caspase-1可能是治疗短暂全脑缺血后神经损伤和功能障碍的很有前途、前景的治疗策略。