戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是一种无包膜的单股正链RNA病毒,共有四种基因型,但只有一种血清型。由该病毒引起的戊型肝炎是全世界范围内的公共卫生问题,孕妇感染戊肝病毒具有较高的死亡率。由于目前缺乏高效的HEV体外培养模型,HEV的感染及中和机制一直未被阐明。HEVORF2编码唯一的结构蛋白并组装成病毒衣壳蛋白,由于HEV无包膜,衣壳蛋白直接参与了病毒吸附、入胞,并诱导宿主免疫应答等过程。重组表达的HEV衣壳蛋白是相关研究的理想对象,对于HEV衣壳蛋白的结构和重要抗原性表位的研究有助于阐明HEV的结构基础和感染、入胞机制,进而为戊肝的预防、诊断和治疗提供理论指导。ORF2编码全长660个氨基酸的结构蛋白,其中aa459-606可形成同源二聚体(E2s),是HEV主要的中和抗体结合区域。本实验室前期筛选获得HEV高亲和力中和抗体8C11,并利用大肠杆菌表达的E2s与中和抗体8C11的Fab制备免疫复合物并解析了复合物结构,阐明了 8C11的识别表位。E2s在体外无法组装成颗粒,而昆虫细胞表达的ORF2p495蛋白(aa112-606)可组装形成T=1的正二十面体对称的病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)。E2s位于颗粒表面二倍轴区域的突起,8C11的识别表位位于二聚体突起的沟槽区。有趣的是,按照已解析的E2s:8C11结构所阐明的结合方式,结合在p495上的8C11将与颗粒上相邻的二聚体突起发生碰撞,提示8C11结合p495颗粒具有较大的空间位阻。为阐明8C11结合p495乃至天然病毒并发挥中和作用的具体机制,本研究利用昆虫细胞表达的p495 VLP,解析颗粒及颗粒复合物的冷冻电镜结构,并在颗粒层面上研究8C11与p495的相互作用。首先,利用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达p495蛋白,组装成VLPs,通过PEG沉淀和阴离子交换层析两步纯化高效地获得纯度大于90%、形态大小均一的p495VLPs,并确定了最佳缓冲条件,验证了颗粒在该缓冲液中的稳定性。酶联免疫实验和小鼠免疫实验验证了 p495VLPs具有良好的抗原性和免疫原性,且与已上市的戊肝疫苗Hecolin(?)相当。进一步的细胞实验表明p495 VLPs能成功吸附HepG2细胞,中和抗体8C11能阻断该吸附。利用冷冻电镜技术,获得分辨率为3.4 A的T=1 p495 VLP结构,与已报道的晶体结构基本一致。再者,利用本研究获得的p495VLPs与中和抗体8C11制备复合物。在此研究中我们发现p495VLPs与8C11形成的免疫复合物极不稳定,在一定时间后颗粒解聚,形成p495单体,二聚体或多聚体的8C11复合物,电镜结果和生化实验都证实了这一现象。而p495 VLPs与另一株抗体3B6形成的免疫复合物却未出现这种解聚现象。利用冷冻电镜单颗粒重构技术,我们解析暂未完全解聚的p495:8C11复合物,分辨率为4.0A,对结构的分析结果显示,复合物表面的E2s部分由于8C11的结合产生较大的无规则形变,对称性被破坏,使得在利用信号叠加方式的重构过程中E2s的部分密度丢失。通过多种重构方法的尝试,均未获得理想的复合物结构,这些结果证明了 8C11的结合会破坏颗粒。作为对照,p495:3B6复合物(9.4 A)能看到完整的p495及Fab密度。由于本研究所观察到的抗体导致的解聚现象是基于VLP,为进一步证实8C11是否对天然病毒也具有解聚作用,我们进一步进行基于真病毒的核酸释放实验,证实了 8C11在真病毒上同样存在潜在的裂解作用。综上所述,本研究借助生物化学、分子生物学和结构生物学等方法,研究阐释了中和抗体8C11结合病毒样颗粒后,由于空间位阻及空间碰撞的存在,对颗粒产生挤压和扭曲,最终导致颗粒的解聚。这种中和抗体结合后由于空间位阻直接对颗粒产生破坏的方式,可能是一种全新的中和抗体中和机制。