目的：巨噬细胞在抗 RNA病毒感染的先天免疫过程中发挥着极为重要的作用。巨噬细胞首先通过模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRR）识别病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），从而激活一系列信号通路，诱导包括IRF3和NF-κB在内的转录因子的活化入核，协同促进 I型干扰素表达和分泌。I型干扰素通过与细胞膜上的干扰素受体相互作用，诱导一系列抗病毒蛋白的表达，这些抗病毒蛋白协同作用，通过抑制病毒复制或诱导被感染细胞的凋亡，实现细胞的抗病毒反应。　　Neddylation属于类泛素化修饰的一种，是 NEDD8（neural precursor cell-expressed developmentally downregulated8）分子经过与泛素化修饰相似的“E1→E2→E3”一系列酶促反应最后与底物共价结合的蛋白质翻译后修饰（post-translational modification, PTM）过程。目前已知的Neddylation过程中唯一的E1酶是由 UBA3和 APPBP1组成的复合物。抑制 UBA3可以抑制 Neddylation修饰过程。Neddylation通过改变底物构象、稳定性以及亚细胞定位等，调节蛋白降解、转录、细胞信号转导等过程，对细胞生命活动至关重要。近期有文献报道 Neddylation在巨噬细胞功能维持、炎症因子（TNF-α、 IL-6等）表达中起到关键作用，而目前国内外对Neddylation在先天免疫尤其是抗病毒免疫中的作用鲜有报道。在这一过程中 Neddylation是否发挥作用，发挥怎样的作用，以及作用的机制如何，均值得进一步探讨。　　本课题应用 Uba3髓系细胞条件性敲除（Lyz-Cre:Uba3F/F; Uba3Δmye）小鼠和 Nedd8髓系细胞条件性敲除（Lyz-Cre:Nedd8F/F; Nedd8Δmye）小鼠，在巨噬细胞抗 RNA病毒感染过程中，Neddylation对 IFN-β（interferon-beta）表达以及巨噬细胞凋亡的影响与机制进行了研究，从而揭示 Neddylation在先天免疫中发挥的作用。　　方法：　　1.以Uba3F/F，Nedd8F/F小鼠分别和溶菌酶（lysozyme，Lyz）启动子驱动 Cre重组酶基因表达的Lyz-Cre转基因小鼠为亲本，建立 Uba3Δmye和 Nedd8Δmye模型小鼠。应用 PCR技术鉴定小鼠基因型，并应用免疫印迹方法在蛋白水平验证 UBA3和 NEDD8是否敲除成功。　　2.分离和培养Uba3Δmye小鼠和Uba3F/F小鼠（Uba3Δmye小鼠为基因敲除鼠，Uba3F/F小鼠为野生型小鼠）骨髓源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）种于6孔板（2×106/孔）；用仙台病毒（Sendai Virus, SEV）刺激BMDMs0h，24h，收集细胞上清，用ELISA的方法检测IFN-β；SEV刺激Uba3F/F和Uba3Δmye小鼠BMDMs0h和8h，基因芯片检测Ifn-b1mRNA表达水平。　　同样分离和培养 Nedd8Δmye和 Nedd8F/F小鼠 BMDMs种于6孔板（2×106/孔）；在不同时间点，0h，4h，8h，12h，24h，用 SEV刺激 BMDMs细胞, Q-PCR方法检测 Ifn-b1mRNA水平；收集细胞上清，用 ELISA的方法检测 IFN-β蛋白水平。　　3.以不同时间点，SEV刺激 Uba3Δmye和 Uba3F/F小鼠，Nedd8Δmye和 Nedd8F/F小鼠BMDMs，收集细胞裂解液，用Western Blot方法检测TANK-binding kinase1（TBK1）-interferon regulatory factor3（IRF3）信号通路和 NF-κB信号通路，包括 UBA3，NEDD8，Actin，phospho-TBK1，IRF3，phospho-IRF3，P-IκBα相关信号分子。　　4.用不同滴度水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）刺激两种基因敲除小鼠以及其对照小鼠 BMDMs细胞0h和4h，ATPlite检测细胞活性；VSV刺激两种基因敲除小鼠以及其对照小鼠 BMDMs0h和8h，免疫印迹检测细胞内凋亡蛋白与抗凋亡蛋白水平及活性。　　5.VSV刺激Uba3Δmye和Uba3F/F小鼠BMDMs8小时，基因芯片检测和免疫印迹检测 p53信号通路相关蛋白的mRNA水平和蛋白；应用 p53通路阻断剂 HLI373（0μM，10μM）预处理 BMDMs12h后，加入 VSV再次重复诱导细胞凋亡，用 ATPlite方法检测细胞活性，观察是否可逆转凋亡效应。　　结果：　　1.Uba3Δmye和Nedd8Δmye小鼠的繁殖与鉴定。　　以 Uba3F/F小鼠，Nedd8F/F小鼠分别和溶菌酶（lysozyme，Lyz）启动子驱动 Cre重组酶基因表达的Lyz-Cre转基因小鼠为亲本，建立 Uba3Δmye 和 Nedd8Δmye模型小鼠。　　模型小鼠是在髓系细胞中敲除 Uba3，基因型为 Lyz-Cre:Uba3F/F，即 Uba3Δmye小鼠；对照小鼠基因型为 Uba3F/F小鼠。经长期观察，Uba3Δmye小鼠出生率与 Uba3F/F小鼠无显著差别，并能健康存活至成年。用 PCR的方法，鉴定其基因型；通过免疫印迹的方法用 BMDMs在蛋白水平上验证 Uba3Δmye小鼠巨噬细胞中 UBA3蛋白成功敲除，证明 Uba3Δmye模型建立成功；同理，建立并验证Nedd8Δmye小鼠模型。敲除Uba3或者 Nedd8是为了抑制 Neddylation过程，从而研究 Neddylation对先天免疫细胞干扰素表达及细胞存活的影响。Uba3Δmye　　2.Uba3Δmye小鼠BMDMs在RNA病毒刺激下，Ifn-b1 mRNA水平和IFN-β蛋白水平均增高；Nedd8Δmye小鼠 BMDMs在 RNA病毒刺激下，Ifn-b1 mRNA水平升高，IFN-β蛋白水平早期降低，晚期增高。　　2.1.SEV刺激Uba3Δmye和Uba3F/F小鼠BMDMs0h和24h，收细胞上清，做 IFN-βELISA，结果显示，Uba3Δmye小鼠 BMDMs IFN-β蛋白表达比对照小鼠明显增高；SEV刺激该种基因敲除小鼠 BMDMs0h和8h，基因芯片检测 Ifn-b1 mRNA水平。结果显示，Uba3Δmye小鼠 BMDMs Ifn-b1 mRNA水平较对照小鼠明显增高（P<0.01）。　　2.2.在不同时间点，用 SEV刺激 Nedd8Δmye和 Nedd8F/F小鼠 BMDMs, Q-PCR方法检测 Ifn-b1 mRNA水平，用 ELISA的方法检测 IFN-β蛋白水平。结果显示，Nedd8Δmye小鼠 BMDMs Ifn-b1 mRNA水平在刺激4，8和12小时较对照小鼠明显增高（P<0.01）；IFN-β蛋白表达水平在4小时和8小时与对照小鼠相比有所降低（P<0.01）；IFN-β蛋白表达水平在刺激12小时和24小时，与对照小鼠相比明显增高（P<0.01）。　　3.Uba3Δmye和Nedd8Δmye小鼠BMDMs中，RNA病毒诱导的IκBα磷酸化增强，IRF3活化亦增强。　　SEV刺激小鼠BMDMs0h，4h，8h，24h，Western Blot检测TBK1-IRF3信号通路和 NF-κB信号通路相关信号通路各分子表达及活化水平。结果显示，Uba3Δmye小鼠和 Nedd8Δmye小鼠 BMDMs中，与各自对照小鼠相比，IκBα磷酸化增强，IRF3磷酸化明显增强，TBK1磷酸化没有增强。　　4.Uba3Δmye和Nedd8Δmye小鼠BMDMs对RNA病毒诱导的细胞凋亡更为敏感。　　4.1.不同滴度 VSV刺激小鼠 BMDMs0h和24h，ATPlite检测细胞活性。结果显示，在 VSV可明显诱导细胞死亡的滴度， Uba3Δmye和Nedd8Δmye小鼠 BMDMs死亡明显多于对照小鼠。　　4.2.VSV刺激小鼠BMDMs0h,8h，免疫印记检测细胞内凋亡蛋白与抗凋　　亡蛋白水平及活性。结果显示，Uba3Δmye小鼠和 Nedd8Δmye小鼠 BMDMs中，UBA3和 NEDD8蛋白分子被敲除，抑制了 Neddylation的过程；敲除小鼠与对照小鼠相比，Uba3Δmye小鼠 BMDMs中 caspase-3等促凋亡蛋白活性增高，Bcl-xl及 Bcl-2等抗凋亡蛋白降低或不变；Nedd8Δmye小鼠BMDMs中caspase-3促凋亡蛋白活性亦增高。　　5.Uba3Δmye小鼠BMDMs中p53信号通路活化增强，促进细胞凋亡。　　5.1.VSV刺激 Uba3Δmye小鼠 BMDMs0h和8h，基因芯片检测结果显示， Uba3Δmye小鼠BMDMs中，p53信号通路Puma mRNA水平增强；免疫印迹结果显示 PUMA及 p53AIP蛋白水平升高。　　5.2.应用 p53通路阻断剂 HLI373（0μM，10μM）预处理 BMDMs12h后，　　加入 VSV再次重复诱导细胞凋亡，用 ATPlite检测细胞活性。未加入阻断剂 HLI373， Uba3Δmye小鼠 BMDMs死亡明显多于对照小鼠（P<0.05）；加入阻断剂 HLI373后，Uba3F/F小鼠和 Uba3Δmye小鼠BMDMs死亡没有差异（P>0.05）。　　结论：　　通过在髓系细胞中特异敲除 Uba3和 Nedd8的方法在小鼠 BMDMs中达到抑制 Neddylation的目的。我们发现，抑制 Neddylation对 RNA病毒诱导产生，早期 IFN-β蛋白水平表达有所降低，推测可能为 IκBα磷酸化增强， IκBα降解障碍，影响 NF-κB入核，而后期 Ifn-b1mRNA水平和蛋白水平表达增高，推测机制为 RNA病毒诱导 IRF3活化增强，作用强于对NF-κB信号通路的影响。虽然后期抑制Neddylation使IFN-β表达增强，但是其对 VSV诱导细胞凋亡却有促进作用，机制可能是抑制Neddylation能够增强 p53信号通路活化，促进细胞凋亡。