长链非编码RNA Serpina3h特征分析及其与SerpinA3亚族基因关系研究

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丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)是迄今为止发现的最大的蛋白酶抑制剂家族,其中SerpinA3亚族作为该家族重要分支,参与多种生理和病理调节过程。作为SerpinA3亚族中目前唯一已知的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)Serpina3h已经开始受到关注,具有很大研究潜力,但目前相关信息还较少。为完善Serpina3h基因序列特征信息并初步探究其功能,本研究以小鼠子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)为实验对象,采用cDNA末端快速扩增、RNA荧光原位杂交、实时荧光定量PCR、流式细胞术等技术结合生物信息学进行研究。本研究所得主要实验结果如下:1.通过RACE实验分别获得了 Serpina3h基因5’/3’末端序列,拼接后全长为2072 bp。生物信息学分析显示Serpina3h是一个假基因,同时也是基因间lncRNA,拥有31个开放阅读框,KEGG在线预测Serpina3h可能参与K04525通路。2.通过RNA-FISH实验发现Serpina3h富集分布在细胞质中。通过构建的pcDNA3.1-Serpina3h质粒载体转染小鼠子宫基质内膜细胞,发现Serpina3h可以上调Serpin3g(P<0.05)、Serpin3c(P<0.001)、Serpin3m(P<0.001)和Serpin3n(P<0.01)相对表达量,与对照组相比分别为7.917 ± 0.442(Serpina3h),2.077±0.880(Serpina3g),64.756±0.075(Serpina3c),91.205 ± 0.823(Serpina3m)and 72.028 ± 2.386(Serpina3n)。3.通过流式细胞术检测了凋亡率,运用荧光定量RCR检测了实验组与对照组细胞中细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9、P53、Bcl-2、Bax和c-myc的转录水平。实验结果表明Serpina3h对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡率没有显著影响(P>0.05),对Caspase-3、Caspase-9、Bax以及c-myc的表达量都没有显著影响(P>0.05),而P53的表达量显著升高(P<0.05),Bcl-2的表达量显著降低(P<0.05),Bax/Bcl-2的比值显著升高(P<0.01)。通过以上实验结果可以得出以下结论:(1)Serpina3h全长2072 bp,带有polyA尾,富集在细胞质中;(2)Serpina3h 能够上调 Serpina3g,Serpina3c,Serpina3m 和Serpina3n 的表达,而且 Serpina3h 对 Serpina3c,Serpina3m 和 Serpina3n 三个基因有类似于增强子的功能效用,显著增加它们的转录频率;(3)Serpina3h与部分细胞凋亡基因相关,能够显著调高P53的表达和Bax/Bcl-2比值,并降低Bcl-2的表达。本研究对Serpina3h序列进行了补充与完善,并进行了功能的初步分析,为今后Serpina3h的深入研究提供了一些帮助。下一步我们将对Serpina3h进行pull down实验,以求获得与其相结合的发挥功能的蛋白或其他物质,从而进一步研究Serpina3h生物学功能。
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