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目的生殖毒性是雷公藤多苷(tripterygium glycosides,TG)治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的临床瓶颈之一。本研究拟从时间学角度探索TG昼夜不同时间给药对雌性大鼠胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)及卵巢功能损伤的影响,并观察菟丝子提取物对CIA大鼠卵巢功能的保护效应,为TG针对RA的时间治疗提供实验依据。方法1选用12周龄健康雌性SD大鼠,置于时间生物学实验室,适应一周后进行实验。选择有动情周期的大鼠纳入实验组,共96只。取80只大鼠建立CIA模型,同期设正常对照大鼠16只。在初次免疫第21天观察并评价造模结果,将造模成功大鼠随机分为CIA模型组、TG日间给药组、TG夜间给药组、TG日间给药+菟丝子提取物给药组、TG夜间给药+菟丝子提取物给药组。空白组和CIA模型组给生理盐水灌胃,TG日间给药组每日9am给TG50mg/kg.d,TG夜间给药组每日9pm给TG 50mg/kg.d,连续给药14d。停药后TG+菟丝子给药组每天灌胃菟丝子提取物0.9g/kg.Bid,连续7d。2采用大鼠阴道脱落细胞涂片检查法观察大鼠动情周期。3采用容积法(排水法)观察双足爪肿胀度的变化;4干预后第15天,采用MINRAY型X线机对大鼠踝、足关节拍X线片。5干预后第15天,分别于ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22共6个不同时间点分别进行摘眼球取血。6放射免疫法检测大鼠血清雌二醇(E2)、促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)分泌水平。7计算卵巢指数;8免疫组织化学法检测白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β)、CLOCK及BMAL1表达水平;9所有正态分布计量资料均采用均数±标准(`x±s)差表示。组间差异采用多样本均数的方差分析进行判断,两两均数比较采用t检验进行判断。使用SPSS17.0软件统计分析,检验水准α=0.05。结果1大鼠动情周期的变化。空白组、CIA模型组大鼠平均动情周期为4~5d/次。TG日间给药组与夜间给药组动情周期均延长为6~7d/次。菟丝子提取物给药组,动情周期为5~6d/次。2大鼠血清E2、LH、FSH水平的变化。与空白组相比,模型组血清E2、LH、FSH分泌水平均未见显著差异(P>0.05),时间治疗组给药后,TG给药组与TG+菟丝子提取物给药组血清E2、分泌水平显著低于空白组与模型组(P<0.05)、LH分泌水平显著高于空白组与模型组(P<0.05);TG给药组血清FSH水平明显高于空白组与模型组(P<0.05),TG+菟丝子给药组血清FSH水平与空白组和模型组差异不明显(P>0.05);与TG组相比,TG+菟丝子提取物给药组血清E2分泌水平显著升高(P<0.05),血清FSH分泌水平降低(P<0.05),LH未见显著差异(P>0.05);与TG日间给药组相比,TG夜间给药组大鼠血清E2分泌水平较高(P<0.05)、FSH分泌水平低但差异不明显(P>0.05),血清LH分泌水平较低(P<0.05);与TG日间给药+菟丝子提取给药组相比,TG夜间给药+菟丝子提取物给药组血清分泌E2分泌水平较高(P<0.05)、FSH分泌水平低但差异不明显(P>0.05),血清LH分泌水平较低(P<0.05)。3大鼠血清E2、LH、FSH水平昼夜变化。各组大鼠血清学指标均显示出一定的节律变化,E2大致呈现出昼低夜高的趋势,LH、FSH则显示出昼高夜低的趋势。其中,E2在ZT22时达到峰值,在ZT10时达到谷值;FSH于ZT18时达到峰值,ZT14时达到谷值;LH峰值发生在ZT10时,谷值发生在ZT22时。TG可使CIA大鼠E2、LH、FSH的昼夜节律发生紊乱或变异,表现为振幅降低,峰值相位偏移。4各组大鼠卵巢指数情况。与空白组相比,模型组卵巢指数未见显著差异(P>0.05),给药后,TG给药组与TG+菟丝子提取物给药组卵巢指数显著低于空白组(P<0.05);与TG组相比,TG+菟丝子提取物给药组卵巢指数未见显著差异(P>0.05);与TG日间给药组相比,TG夜间给药组大鼠卵巢指数较高(P<0.05);与TG日间给药+菟丝子提取物给药组相比,TG夜间给药+菟丝子提取物给药组卵巢指数较高(P<0.05)。5大鼠关节肿胀度变化情况。除空白组外,随着造模时间的延长,关节肿胀度逐渐增加,双后足红肿逐渐加重,后缓慢降低。与空白组相比,模型组差异显著(P<0.05);与模型组相比较,TG给药组与TG+菟丝子提取物给药组肿胀度显著下降(P<0.05);与TG日间给药组相比,TG夜间给药组肿胀度显著降低(P<0.05);与TG日间给药+菟丝子提取物给药组相比,TG夜间给药+菟丝子提取物给药组肿胀度显著降低(P<0.05)。6关节影像学评价。空白组大鼠踝关节X线观察踝关节关节面清晰,掌指关节骨皮质整齐、光滑,关节间隙未见异常。模型组大鼠踝关节关节面模糊,有明显骨质破坏,关节间隙变窄或消失,周围软组织阴影度肿胀明显增厚。TG日间给药组大鼠踝关节面破坏、模糊,部分关节可见骨缺损。TG夜间给药组大鼠关节面也呈现不同程度的破坏,较日间给药组稍轻,周围软组织阴影肿胀度明显减轻。7卵巢组织HE染色观察。空白组与模型组卵巢组织结构正常,体积大,卵泡生长活跃,可见各级卵泡、成熟卵泡及黄体。成熟卵泡中颗粒细胞层次多,卵泡液丰富,黄体发育好。TG日间给药组卵巢较空白组卵巢体萎缩,散在慢性炎细胞浸润,大部分区域被纤维结缔组织及脂肪组织取代,残留有早期生长卵泡,组织中各级卵泡减少,有明显卵泡水肿,黄体数量减少。TG夜间给药组卵巢体较空白组减小,各级卵泡减少,部分卵泡内可见淋巴细胞浸润。菟丝子提取物给药组卵巢体较空白组小,病变较轻,少量淋巴细胞浸润。8免疫组织化学法检测结果。空白组大鼠踝关节HE染色可见滑膜平滑,1~2层滑膜细胞,无乳突状突起或增生,未见多核细胞浸润。模型组CIA大鼠踝关节HE染色可见软骨破坏,滑膜细胞增生严重,乳突状凸起,大量炎性细胞浸润。TG日间给药组大鼠踝关节可见滑膜细胞增生,乳突状凸起,大量炎性细胞浸润;TG夜间给药组大鼠踝关节滑膜增生较轻,乳突状凸起,少量炎性细胞浸润。免疫组织化学检测大鼠踝关节IL-1β、IL-6、CLOCK及BMAL1表达,观察发现模型组大鼠滑膜细胞IL-1β、IL-6、CLOCK及BMAL1表达量均明显高于空白组表达。结论1正常和CIA模型大鼠血清E2、LH、FSH分泌水平存在昼夜节律;TG给药导致上述昼夜节律发生紊乱或变异,表现为振幅降低、峰值相位偏移。2TG可导致雌性CIA大鼠卵巢功能不同程度损害;TG于昼夜不同时间给药对雌性CIA大鼠卵巢功能的损害存在差异,夜间给药较日间给药损害为轻。3TG致雌性CIA大鼠卵巢功能损伤的机制可能与其影响昼夜节律基因CLOCK及BMAL1的表达相关。4中药菟丝子提取物对TG致CIA大鼠卵巢功能损伤有一定的保护作用。