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维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种重要的水产病原菌,对水产养殖业造成巨大的经济损失,因此研制水产疫苗是必需的,由于其接种受限因素较多,开发新型口服疫苗并选择合适的抗原对水产疫苗的研制具有重要意义,细菌鞭毛蛋白能与TLR5特异性结合,从而诱导机体释放细胞因子,可被应用于疫苗的研制中。本试验主要分为以下两部分实验:试验一通过克隆A.veronii TH0426株flaA基因,并构建原核表达系统和2种重组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),分别是细胞表面表达型Lc-MCS-flaA和分泌表达型Lc-pPGflaA,通过Western blotting和间接免疫荧光验证蛋白表达情况。结果表明:经过PCR能扩增得到900bp左右flaA基因片段,Western blotting条带清晰,蛋白大小33kDa;通过荧光显微镜可见Lc-MCS-flaA有明显荧光信号。为评估重组L.casei的免疫保护效果,本试验以鲫作为试验动物,将重组L.casei经过乳糖诱导后混合海藻酸钠包被颗粒饲料投喂鲫,在免疫前0d、免疫后7、16、25和34d采取组织和血液,检测免疫相关指标;检测重组L.casei定植情况,单独设定试验组,连续投喂7d,空腹28d后无菌采集前、中和后肠,利用抗性平板进行计数;攻毒检测免疫保护率。采用ELISA方法检测血清中IgM、ACP、AKP、SOD、IL-10、IL-1β、TNF-α、IFN-γ指标。结果表明:各项指标经过口服免疫后都有所提升,通过口服方式免疫鲫能够诱导鲫体液免疫分泌IgM和各类免疫指标;同时白细胞吞噬活性与分化能力都有所加强;利用qRT-PCR检测各组织IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ细胞因子的转录水平,结果表明:重组L.casei通过定植肠道刺激黏膜,使细胞因子的转录水平呈上调趋势,从而提升鲫免疫力,定植情况也表明经过28d的空腹,肠道内仍存在重组L.casei,表明其定植能力良好;攻毒后观察28d,发现重组L.casei能有效缓解A.veronii造成的急性感染,在一定程度上起到保护作用。试验二成功克隆A.veronii TH0426株flaB基因,并通过构建原核表达系统诱导表达纯化FlaB蛋白,利用鼠抗A.veronii TH0426血清证明其具有抗原性;以鱼源L.casei作为抗原递呈载体,构建2种不同表达形式的重组L.casei(Lc-pPG-flaB和Lc-MCS-flaB),经过基因和蛋白水平的验证,结果表明:Lc-pPG-flaB和Lc-MCS-flaB均能表达FlaB蛋白,且Lc-MCS-flaB能将目的蛋白锚定在细胞表面;免疫及指标测定方法同试验一,结果表明:Lc-MCS-flaB和Lc-pPG-flaB能够诱导机体产生高水平的IgM,且Lc-MCS-flaB能诱导机体产生更高水平的IgM;重组L.casei能有效诱导体液免疫,提高血清中各项免疫指标,包括SOD、ACP、AKP和LZM等;同时加强白细胞分化能力进而提高白细胞吞噬活性;通过qRT-PCR结果分析,重组L.casei能有效提高鲫各组织中免疫相关细胞因子的表达,且能够定植在鲫肠道内;攻毒后,且结果表明重组L.casei能有效保护鲫并缓解A.veronii的侵袭。综上所述,本试验成功构建4株重组L.casei,经过口服的方式免疫鲫可诱导机体产生体液免疫应答,产生高水平IgM和上调免疫相关酶活性,同时促进白细胞分化和加强其吞噬活性,提高机体体液免疫应答,各组织细胞因子的转录水平也呈上调趋势,重组L.casei能有效保护鲫并提高机体免疫力,试验结果为水产口服乳酸菌疫苗的研制提供理论基础。