论文部分内容阅读
目的：2型糖尿病是一种自身免疫和低度炎症性疾病，且2型糖尿病存在着细胞因子介导的急性相反应，细胞因子可通过多种机制引起炎症反应，最终引起或加速糖尿病及其并发症的发生。甘露（聚）糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)是一种主要由肝脏合成的急性时相蛋白，在天然免疫中发挥重要作用。研究发现，MBL水平与多种疾病有关，MBL缺失或含量低下可增加感染性疾病的易感性和感染的严重程度。本研究的主要目的是调查糖尿病人与健康人血浆MBL、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量变化和MBL基因Exon I54位密码子基因突变的频率，并分析其变化情况，从固有免疫的角度探讨糖尿病的可能致病机制，为进一步探讨MBL和细胞因子在糖尿病发生、发展的机制及其在糖尿病治疗中的应用奠定基础。
方法：
1.标本的收集与处理收集131例2型糖尿病患者空腹静脉血，100例健康对照者空腹静脉血，均为全血标本(EDTA-K2)，分离血浆与细胞成分，血浆用于MBL、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量测定，细胞成分用于提取DNA。
2.DNA提取及MBL基因突变分析采用低渗溶解法溶解红细胞，提取白细胞，再用盐酸胍法提取白细胞中DNA。用PCR-RFLP法检测MBL基因ExonI54位密码子突变基因，扩增体系为25μL，其中10×Buffer2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2.0μL，Primerl(50μmol/L)0.2μL,Primer2(50μmol/L)0.2μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，模板2.0μL，灭菌三蒸水补至25μL。扩增参数为：预变性95℃5min;95℃45s、55℃45s，72℃1min，循环30次；末延伸72℃5min。扩增产物用TAE配制含0.5μg/ml溴化乙啶2％的琼脂糖凝胶电泳，加样5μL/孔，电泳30min;PCR Marker作为参照，对扩增产物进行分析。对扩增产物用限制性内切酶(BshN I)酶切：酶切体系为31μL，其中：BshNI(10u/μL)0.5μL，10×Buffer2μL，DNA扩增产物10.0μL，灭菌三蒸水18.5μL，37℃水浴反应大于3小时，酶切产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析。经统计学处理后比较DM组和健康对照组MBL ExonI54位密码子点突变频率是否具有统计学差异。
3.血浆中细胞因子检测采用ELISA法测定标本血浆中MBL、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量。应用统计学方法处理分析，比较DM患者组和健康对照组血浆细胞因子含量是否具有统计学差异。
结果：
1.MBL基因突变分析：应用PCR-RFLP法对提取的标本DNA进行扩增，扩增产物用BshNI酶切后电泳出现三种情况：显示一条带，DNA片断大小为330bp;显示两条带，对应的DNA片断大小分别为236bp和94bp;显示三条带，对应的DNA片断大小分别为330bp、236bp和94bp，三种情况分别代表54位密码子为纯合突变型、野生型和杂合突变型，不同类型标本酶切后电泳结果与测序结果一致。实验结果得出MBL基因ExonI54密码子基因在DM患者突变(GAC)频率为14.5％，正常对照组突变频率为17％。
2.血浆MBL含量及细胞因子测定结果：DM组MBL的含量为1840±602μg/L，健康对照组MBL的含量为2003±718μg/L，两组相比t=-1.867，P=0.063＞0.05;DM组IL-6的含量为505±212ng/L，健康对照组IL-6的含量为436±231ng/L，两组相比t=2.336，P=0.02＜0.05;DM组IL-8的含量为1030±365ng/L，健康对照组IL-8的含量为945±600ng/L，两组相比t=1.333，P=0.184＞0.05;DM组IL-17的含量为257±135ng/L，健康对照组IL-17的含量为138±66ng/L，两组相比t=8.101，P=0.000＜0.01;DM组IL-23的含量为2316±952ng/L，健康对照组IL-23的含量为1958±1326ng/L，两组相比t=2.389，P=0.018＜0.05。
结论：
1.糖尿病组血浆IL-6和健康对照组相比升高，有统计学意义(P＜0.05)；糖尿病组血浆IL-8和健康对照组相比略高，但无统计学意义（P＞0.05）；糖尿病组血浆IL-17和健康对照组相比明显升高，有统计学意义(P＜0.01)；糖尿病组血浆IL-23和健康对照组相比升高，有统计学意义（P＜0.05）。
2.糖尿病组血浆MBL含量以及MBL Exon I54位密码子基因突变(GAC)频率均有降低倾向，但无统计学意义。
所得实验结果可见2型DM的发生与MBL ExonI基因突变无直接因果关系。IL-6、IL-17、IL-23在DM患者中明显升高，而IL-8的升高不明显，这些细胞因子的变化可能与2型DM的发生有关，MBL含量低下可能会加重糖尿病的严重程度。