第一部分FOXM1在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义目的：探明FOXM1在人卵巢癌组织标本及细胞株中的表达情况，分析卵巢癌组织中FOXM1表达与临床病理参数之间的关系。方法：采用免疫组化SP法检测68例卵巢癌临床标本、21例卵巢良性肿瘤标本、24例正常卵巢标本中FOXM1的表达情况；应用间接免疫荧光技术及Western blot技术分析人卵巢上皮细胞HOSEpiC，及人卵巢癌细胞A2780、OVCAR3、SKOV3等细胞中FOXM1的表达情况。结果：卵巢癌组织中FOXM1表达显著高于卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织（p<0.01），其中低分化细胞中表达强于中高分化细胞(P=0.013)，Ⅲ～Ⅳ期表达强于Ⅰ～Ⅱ期(P=0.011)，但与病理类型无关；FOXM1在A2780、OVCAR3、SKOV3等细胞中的表达均明显高于HOSEpiC细胞（P<0.01），其中又以SKOV3细胞表达量最高（P<0.05）。结论：FOXM1在卵巢癌组织及卵巢癌细胞株中均存在明显过度表达现象，其表达量与细胞分化程度呈反比，与临床分期呈正比关系。第二部分靶向人FOXM1基因的shRNA慢病毒载体的构建与鉴定目的：构建并鉴定靶向人转录因子FOXM1基因的shRNA慢病毒载体。方法：设计合成靶向人FOXM1基因的shRNA表达序列，通过基因重组技术将其连接到含有U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pLL3.7中，并对重组质粒进行Xba I和Nhe I双酶切鉴定及DNA测序鉴定，序列测定正确的重组质粒与慢病毒包装质粒pMD2G、pRsv-REV、pMDLg-pRRE混合，应用脂质体LipofectamineTM2000共转染至293T细胞中收集纯化慢病毒颗粒，并采用逐孔稀释法测定慢病毒滴度；将制备的慢病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞96h后，应用Real time PCR技术及Western blot技术分别分析SKOV3细胞FOXM1mRNA及FOXM1蛋白表达量的变化。结果：双酶切鉴定及测序结果提示靶向人FOXM1基因的shRNA序列成功插入至pLL3.7中，并成功包装出滴度为1×108TU/ml的慢病毒颗粒，用此病毒感染SKOV3细胞96h后，细胞FOXM1mRNA相对表达量下降至21.3%±2.09%，FOXM1蛋白下降至17.6%±1.17%。结论：成功构建了干扰效果显著的靶向人FOXM1基因的shRNA慢病毒载体，为进一步揭示FOXM1的分子功能奠定了基础。第三部分慢病毒介导的FOXM1基因沉默对SKOV3细胞生长的影响目的：研究靶向FOXM1的shRNA慢病毒载体对SKOV3细胞体外生长的影响及可能的分子机制。方法：应用感染复数（MOI）为20的靶向FOXM1的shRNA慢病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞96h后：MTT法检测增殖抑制率；流式细胞术分析细胞周期变化；Hoechst33258染色及TUNEL法观察凋亡发生情况；吖啶橙染色、单丹黄酰尸胺、LC3-II免疫荧光染色、扫描电镜及透射电镜观察细胞自噬发生情况；Real time PCR技术及Westernblot技术检测P21、PLK1、Bax、Bcl-2、Beclin1、LC3-II等分子的mRNA及蛋白的表达变化。结果：靶向FOXM1的shRNA慢病毒载体感染SKOV3细胞96h后能显著抑制细胞增殖；将细胞阻滞于G1期；未见明显凋亡形态学变化；细胞自噬活性明显增强；并使P21、Beclin1、LC3-II等分子mRNA及蛋白水平上调（P<0.01），PLK1下调，Bax、Bcl-2无变化。结论：抑制FOXM1表达后，体外培养SKOV3细胞生长明显受抑，可能与细胞周期阻滞及自噬活性增强所诱导的自噬性细胞死亡（II型程序性细胞死亡）有关，而上调P21、Beclin1、LC3-II等分子的表达、下调PLK1的表达可能是其分子机制。第四部分沉默FOXM1前后SKOV3细胞miRNA差异表达谱的建立目的：探明沉默FOXM1前后，SKOV3细胞miRNA差异表达谱，以明确FOXM1与miRNA之间的调控关系。方法：应用miRNA芯片技术，分析沉默FOXM1前后细胞内差异表达的miRNA，并对芯片所筛选的差异miRNA应用Real time PCR技术进行实验验证，以确定其真实差异性。结果：沉默FOXM1表达后，SKOV3细胞内共有42个miRNA发生表达量的变化，其中上调的miRNA有30个，上调超过5倍的miRNA有7个，分别为hsa-miR-451、hsa-miR-122、hsa-miR-636、hsa-miR-1297、hsa-miR-1301、 hsa-miR-185、 hsa-miR-659，其中hsa-miR-451及hsa-miR-122的上调倍数达20倍及95倍；下调的miRNA有12个，下调超过5倍的miRNA有2个，分别为hsa-miRPlus-E1201、hsa-miRPlus-E1074；Real time PCR技术证实miR-185为真实差异表达miRNA。结论：成功建立了FOXM1相关的、42个差异miRNA组成的差异表达谱，确定miR-185为沉默FOXM1后上调的miRNA。第五部分miR-185对SKOV3细胞生长的影响及其靶基因预测验证目的：研究改变miR-185的表达量对SKOV3细胞生长的影响；构建含靶基因RAB14mRNA3’UTR的双荧光素酶报告基因质粒，以从结构学角度验证miR-185的靶基因。方法：①应用miR-185mimics及miR-185inhibitor模拟上调及下调SKOV3细胞miR-185的表达量后：MTT法检测细胞增殖抑制率；流式细胞术检测细胞周期分布情况；吖啶橙染色、LC3-II免疫荧光染色观察细胞自噬发生情况；透射电镜观察细胞超微结构改变。②应用生物信息学手段对miR-185、miR-659及miR-639等3个FOXM1相关差异表达miR-185进行靶基因预测，并对miR-185靶基因RAB14进行相关分析。③应用分子生物学方法，将野生型及突变型miR-185靶基因RAB14基因mRNA的3’UTR重组至含双荧光素酶报告基因序列的pmiR-RB-REPORTTM质粒中，构建重组报告基因质粒，对重组质粒进行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。④应用已构建的重组质粒与miR-185mimics或miR-185inhibitor共转染SKOV3细胞，应用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞内双荧光活性的变化。结果：①miR-185mimics上调miR-185后，细胞增殖明显受抑（P<0.01）；细胞停滞于G1期（P<0.01）；未见明显自噬活性增强及凋亡变化；miR-185inhibitor下调miR-185后对细胞增殖、周期、自噬、凋亡均未见变化。②生物信息学预测提示， RAB14为miR-185的候选靶基因，共得25个miR-185候选靶基因。CTNNBIP1、VEGFc为miR-659的候选靶基因，AKT1、PKN1为miR-639的候选靶基因。③经双酶切及DNA测序鉴定，成功构建含野生型及突变型RAB14基因3’UTR的重组质粒pmiR-RB-REPORTTM-RAB143’UTR及pmiR-RB-REPORTTM-RAB143’UTR-M。④上调miR-185后，报告基因海肾荧光素酶活性下降，提示RAB14为miR-185的结构学靶基因。结论：上调miR-185后能明显抑制细胞增殖，使细胞周期停滞于G1期，这可能与miR-185下调其靶基因RAB14的表达量有关。第六部分“FOXM1/miR-185/RAB14”分子网络对卵巢癌裸鼠移植瘤生长的调控作用目的：研究抑制FOXM1表达、上调miR-185后对SKOV3细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用及可能的分子机制。方法：建立20只卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤实验动物模型，用靶向FOXM1的shRNA慢病毒及miR-185agomir分别进行瘤体注射治疗，治疗结束后分析其抑瘤率；HE染色观察肿瘤组织及裸鼠主要器官形态变化；透射电镜分析瘤体组织超微结构改变；Western blot技术分析瘤体组织FOXM1、P21、PLK1、Beclin1、LC3-II、RAB14的变化。结果：成功建立了卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤动物模型， HE染色见治疗后肿瘤组织细胞稀释疏，裸鼠器官未见明显异常；电镜见抑制FOXM1后细胞出现自噬体，而上调miR-185后出现坏死等变化；Western blot提示抑制FOXM1后瘤体蛋白P21、Beclin1及LC3-II上调，RAB14、PLK1下调，上调miR-185后瘤体P21上调、RAB14下调。结论：抑制FOXM1表达、上调miR-185均可抑制卵巢癌裸鼠移植生长，其中前者抑瘤作用可能通过诱发自噬性细胞死亡及细胞周期阻滞而实现，后者则可能通过阻滞细胞周期而实现。综合本研究结果及文献结果，我们绘制了FOXM1调控SKOV3细胞生长的分子网络图：本研究绘制的调控SKOV3细胞生长“FOXM1/miRNA/靶蛋白”分子网络图Molecular network map of "FOXM1/miRNA/target protein” of regulation growth ofSKOV3cells based on our research