梨小食心虫是一种重要的世界性果树害虫,桃、梨、苹果等蔷薇科仁果类和核果类果树是其主要的寄主植物。梨小食心虫具有典型的季节性转移寄主危害习性,在我国春季和夏初主要为害桃树新梢,夏末和秋季转移至梨园危害梨果,这一习性是引起桃梨混栽区梨小食心虫常年猖獗成灾的重要原因。研究表明寄主植物释放的挥发物组分变化是诱导该虫季节性转移寄主危害的重要原因,灵敏的嗅觉系统在梨小食心虫觅食、求偶、繁殖中起着重要作用。目前,梨小食心虫识别寄主植物挥发物的机制问题还不清楚。梨小食心虫嗅觉相关蛋白基因的鉴定及功能解析有助于掌握昆虫嗅觉识别的分子机制,也可为干扰昆虫嗅觉识别来防治目标害虫提供理论依据。本文通过二代转录组测序,从梨小食心虫触角中鉴定到大量的嗅觉相关基因,并对气味结合蛋白、化学感受蛋白的组织表达、结合特性及与配体的特异性结合机制等进行了系统深入的研究,主要结果如下:采用Illumina Mesiq二代测序平台对梨小食心虫雌虫触角进行转录组测序,利用SOAPdenovo-Trans,Trans-ABySS和Trinity组装软件对转录组数据分别进行从头拼接,并用DETONATE和Transrate对组装的准确性进行评估,结果表明Trinity获得的转录本数量最多、平均长度最长、N50最大,Trans-Abyss次之,SOAPdenovo-trans组装效果最差。通过基因功能注释从梨小食心虫触角转录组中鉴定出28个气味结合蛋白OBP基因,17个化学感受蛋白CSP基因,48个气味受体OR基因,4个味觉受体GR基因,24个离子受体IR基因,2个感受神经元膜蛋白SNMP基因及1个气味降解酶ODE基因。在鉴定到的28个OBP中,21个具有完整的开放阅读框,长度357~756 bp。在具有完整编码区的21个OBP中,GmolOBP14第2、5位的半胱氨酸被其他氨基酸取代,属于“Minus C”亚族OBP,其他20个OBP具有六个保守的半胱氨酸残基及N端20个左右的信号肽序列,属于“典型OBP”。半定量RT-PCR显示,GmolOBP1除在雌、雄虫触角中表达外,还在雌虫身体中表达;GmolOBP2特异性地在雌虫触角和身体中表达;GmolOBP6和Gmol OBP18广泛分布在触角及身体其他组织。其他22个OBP基因在触角中特异性表达。推测在触角中特异性或高表达量的OBP在梨小食心虫寄主定位、产卵场所选择等行为中起着重要作用。在鉴定到的17个CSP中,15个具有完整的开放阅读框,均具有4个保守的半胱氨酸残基和N端17~25个氨基酸组成的信号肽。半定量RT-PCR表明,除CSP6、CSP7和CSP9在触角中特异性表达外,其余CSP在雌、雄虫触角和其他组织中均有分布。梨小食心虫CSP除能感受识别挥发性气味物质外,还可能参与其他的生理活动。利用原核表达系统成功表达了5个OBP蛋白和5个CSP蛋白,并采用His标签亲和层析柱对重组蛋白进行了纯化。利用荧光竞争结合试验对重组OBP和CSP的结合能力进行测定,结果表明:(1)5个重组obp蛋白均能与梨小食心虫的1种或多种性信息素强烈结合,而5个csp蛋白均不能与性信息素结合。(2)gmolgobp1具有广泛的结合谱,与癸烷的结合能力最强,结合常数为5.64μm;gmolgobp1对醇类、酯类物质也有较高的结合活性。表明gmolgobp1具有识别寄主植物挥发物和性信息素的双重功能。(3)gmolgobp2能特异性地结合性信息素十二烷醇,gmolgobp2具有与pbps相似的功能,推测gmolgobp2在成虫求偶、交配中起重要作用。(4)gmolobp8、gmolobp11与癸醛、己酸丁酯和α-罗勒烯的结合能力最强,结合常数分别为9.82,10.03,11.06μm和12.69,12.97,16.79μm。(5)gmolobp15与己醛、庚醛的结合能力最强,结合常数分别为5.52和14.81μm。gmolobp15的主要功能与结合己醛、庚醛等醛类寄主植物挥发物有关。(6)gmolcsp8能与己醇、3-甲基丁醇等小分子量的醇类物质特异性结合,而gmolcsp2、gmolcsp3、gmolcsp9和gmolcsp11与寄主植物挥发物的结合能力很弱或不结合。与obp相比,梨小食心虫csp蛋白与气味分子的结合更具特异性,在成虫嗅觉识别中的作用还待进一步深入研究。以家蚕bmorgobp2和尖音库蚊cpipcsp的晶体结构为模板分别模拟了gmolgobp2和gmolobp8的三维空间结构。预测gmolgobp2结合十二烷醇的可能位点为thr9,val111和val114,gmolobp8结合乙酸-反-8-十二碳烯酯的可能位点为thr70,leu74和trp108。利用定点突变技术将预测的结合位点进行点突变。gmolgobp2的突变体t9a与十二烷醇的结合活性下降了80%,而v111a和v114a没有明显的差异,表明thr9是gmolgobp2结合十二烷醇的关键位点。gmolobp8突变体w108a完全不能与乙酸-反-8-十二碳烯酯结合,t70a和l74a的结合能力显著降低,表明thr70和leu74是gmolobp8的结合位点,而trp108是结合乙酸-反-8-十二碳烯酯关键功能位点。全量荧光免疫定位试验表明,gmolgobp2和gmolobp8均分布在雌、雄虫触角的锥形感器中,且gmolgobp2在锥形感器被荧光标记的数量较gmolobp8多。由gmolgobp2和gmolobp8在锥形感器中表达,且能与性信息素强烈结合的证据表明,表达gmolgobp2和gmolobp8蛋白的锥形感器中的嗅觉神经元对性信息素组分也较敏感。性信息素乙酸-顺-8-十二碳烯酯、乙酸-反-8-十二碳烯酯和顺-8-十二碳烯醇仅对雄虫触角具有电生理活性。桃、梨寄主植物挥发物1-己醇、反-2-己烯醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛、苯甲醛、乙酸丁酯、乙酸-顺-3-己烯酯、乙酸己酯、己酸丁酯均能引起雌、雄虫触角较强烈的eag反应,且雌雄虫触角对寄主植物挥发物的敏感性存在性别差异,如雌虫对己醛、庚醛、壬醛、癸醛和己酸丁酯的eag反应强于雄虫,雄虫对乙酸-顺-3-己烯酯、乙酸己酯的eag敏感性强于雌虫。双向行为选择试验表明具有电生理活性的气味物质并不一定有行为活性。昆虫对寄主植物的识别主要是基于对寄主植物化学气味指纹图谱的确认,但寄主植物释放的某些关键挥发物对昆虫的定位起着重要的指向作用。如反-2-己烯醛和己酸丁酯对雌虫有显著的引诱作用,α-蒎烯对雄虫表现出强烈的吸引作用。梨小食心虫触角中高表达的GmolGST1属于昆虫胞质型GSTs的delta亚家族基因。Gmol GST1在35℃,pH 7.0 100 mM Tris-HCl环境中的酶活力最高。以CDNB和GSH为底物,测定GmolGST1的米氏常数Km为0.232±0.060 mM,最大反应速度Vmax为172.80±15.40μmol/mg/min。杀虫剂对GmolGST1具有一定的抑制作用,但抑制率均低于30%。Gmol GST1对性信息素顺-8-十二碳烯醇的降解能力最强,降解效率高达76.43%,对寄主植物挥发物己酸丁酯也有较强的活性,降解效率达49.19%。GmolGST1的主要功能是对进入触角感器细胞内的气味分子或异源有毒物质进行清除,保证嗅觉系统免受损害。