研究背景及目的 趋化因子受体4(CXCR4)在包括肾细胞癌在内的人类恶性肿瘤中表达广泛,其与配体基质细胞衍生因子-1(SDF-1)组成的SDF-1/CXCR4轴在诱导肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞增殖,以及驱使肿瘤细胞发生器官特异性转移方面发挥至关重要的作用。近年来的研究表明,除了CXCR4的表达水平,CXCR4蛋白在细胞内的分布状态也是影响肿瘤生物学特性及患者预后的重要因素。本课题前期研究发现,在不同来源的肾癌标本中CXCR4呈现不同的亚细胞分布,肾癌原发灶中以细胞膜分布为主,而在转移灶中以胞内分布为主。通过SDF-1体外持续刺激肾癌细胞可促使分布在细胞膜的CXCR4进入细胞质,甚至细胞核。目前,导致CXCR4发生上述亚细胞分布改变,尤其是发生细胞核分布的机制尚不清楚,CXCR4核分布对细胞功能的影响也鲜有研究。本课题旨在探索影响CXCR4亚细胞分布尤其细胞核分布的因素,以及CXCR4亚细胞分布改变对肾癌细胞生物学功能的影响。研究方法 1)采用重叠延伸聚合酶链式反应构建含NLS突变序列的CXCR4-EGFP融合基因(CXCR4 Mut-EGFP)质粒,显微镜下观察质粒转染肾癌细胞后CXCR4蛋白的亚细胞分布尤其是核分布的情况。2)构建稳定表达CXCR4-EGFP和CXCR4 Mut-EGFP的A498、ACHN肾癌细胞株,比较两者在增殖、迁移、侵袭、细胞周期及细胞凋亡等方面的差异；质谱分析及GFP-Trap法筛选与CXCR4蛋白特异结合的蛋白质,文献回溯其中可能影响CXCR4亚细胞分布的蛋白质。3)选取非肌肉性肌球蛋白ⅡA(NMIIA)为研究对象,Western Blot法比较SDF-1刺激后CXCR4核定位阳性肾癌细胞内各亚细胞区CXCR4、NMⅡA表达量的改变,组织标本免疫染色确定CXCR4蛋白是否分布于细胞核膜；观察NMⅡA功能受抑后CXCR4核定位阳性及CXCR4核定位阴性肾癌细胞中CXCR4蛋白亚细胞分布及细胞功能的变化情况,分析CXCR4亚细胞分布改变及CXCR4核分布对肾癌侵袭、转移能力的影响。结果1)实验成功构建了核定位信号突变的CXCR4-EGFP的融合基因质粒,CXCR4蛋白NLS序列中任意一位碱性氨基酸突变均能诱使CXCR4蛋白的核定位能力丧失；野生型CXCR4蛋白在肾癌细胞的胞膜、胞浆、胞核周边及胞核内部均有分布,CXCR4 Mut蛋白仅分布于肾癌细胞的胞膜、胞浆及胞核周边,无法进入细胞核内部。2)实验成功构建了表达CXCR4-EGFP(CXCR4核定位阳性)和CXCR4 Mut-EGFP (CXCR4核定位阴性)融合蛋白的肾癌细胞株。体外实验显示,与CXCR4核定位阴性的肾癌细胞相比,CXCR4核定位阳性的肾癌细胞具有更强迁移及侵袭能力(P<0.05),而两种细胞在细胞周期、细胞凋亡方面无显著差异；文献回溯质谱分析结果中可与CXCR4特异结合的蛋白,提示非肌肉肌球蛋白ⅡA可能参与CXCR4亚细胞分布及核定位的调控过程。3)SDF-1刺激后CXCR4核定位阳性肾癌细胞中NMIIA蛋白总表达量及其在细胞质、细胞核的表达量均无明显变化,而CXCR4蛋白总表达量减少,其在细胞核的表达量增加,在细胞质的表达量无明显变化；组织标本免疫染色证实CXCR4可分布于肾癌细胞核膜；在肾癌细胞内抑制NMIIA的功能可使CXCR4细胞核内表达量减少,CXCR4细胞膜及细胞核膜表达量增加；在CXCR4核定位阴性肾癌细胞中,增加CXCR4细胞膜表达量可显著升高发生迁移的细胞数,但并不能显著改变发生侵袭的细胞数。结论1)完整的核定位信号决定了CXCR4蛋白是否能够进入细胞核,通过改变NLS序列中任一位碱性氨基酸均能诱使CXCR4蛋白的核定位能力丧失。2)CXCR4核定位阳性与CXCR4核定位阴性的肾癌细胞具有不同的生物学特性,CXCR4核定位阳性的肾癌细胞具有较强的迁移及侵袭能力。3)CXCR4蛋白可分布在肾癌细胞核膜,其具体功能尚不明确。4)NMIIA影响CXCR4蛋白亚细胞分布,通过抑制NMIIA可增加后者在细胞膜及细胞核膜的表达量。5)CXCR4蛋白的亚细胞分布状态影响肾癌细胞的侵袭和转移能力,增加CXCR4细胞膜的表达量有助于提高细胞的迁移能力。6)肾癌细胞的生物学特性受分布于各亚细胞区的CXCR4蛋白的共同影响,其具体机制有待进一步研究。