[研究背景]鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国南方一种常见的恶性肿瘤,多发生于广东、广西、四川等地区,年发病率为10-50/105,而欧美国家的年发病率仅为0.5-0.6/105,因此鼻咽癌又称“广东瘤”,大约60%的患者在颈部淋巴结发生转移后,因颈部肿物而就诊,临床穿刺或活检证实为鼻咽癌颈部淋巴结转移后,已属后期。虽对放疗敏感,但仍约有30%—40%的鼻咽癌患者死于鼻咽癌复发或远处转移,所以,研究其转移的机制成为鼻咽癌防治的重要的环节之一。侵袭和转移是恶性肿瘤最重要、最基本的生物学特征,是临床上绝大多数患者的致死原因,也是临床上治疗失败的关键因素。由于到目前为止肿瘤的发病和转移机制仍然不清,所以,无论临床医学和基础医学,研究并阐明肿瘤细胞侵袭和转移的机制一直是肿瘤研究的前沿和热点之一。从肿瘤细胞本身的特性到宿主的反应,国内外的学者进行了大量的研究。研究的结果证实,肿瘤的侵袭与转移是宿主与肿瘤细胞之间一系列复杂的、多因素的、多步骤相互作用的结果。近年来,大量的实验揭示,肿瘤细胞转移的各个阶段,如与细胞外基质的相互作用、肿瘤细胞的运动、黏附侵袭及转移本身,都与肿瘤细胞的跨膜信息传递机制密切相关。通过研究发现肿瘤的增生与转移分别影响不同的信息传递环节,跨膜信息传递体系失常在肿瘤的发生及其失控的增生与侵袭和转移中都起着关键作用。最近的研究发现,PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶)信号传导是一个独立的信号通路,参与多种生长因子的信号传导,与人体的多种功能有关。磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)家族,是一类特异性地催化磷酯酰肌醇(phos-phatidylinositol,PI)3位羟基磷酸化,产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶。丝/苏氨酸激酶(serine threonine kinase,AKT)信号通路主要负责由P13K始动的生物信息的传导,AKT处于这一信号通路的中心环节,其功能除了涉及细胞周期调控、凋亡启动等细胞生存调节外,还参与血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多重要的生理及病理过程。AKT基因有AKT1/PKB、AKT2/PKBβ、AKT3/PKBγ3种亚型,AKT在PI3K(phosphatidylinositol-3kinase),PDK1(3-phosphoinositide-dependentki nase-1),ILK(Integrin-linked kinase)的作用下发生2个位点的磷酸化,一个是催化结构域的Thr308位点,一个是调节结构域的Ser473位点,只有2个位点的磷酸化才能使AKT充分活化。活化的AKT在介导细胞生长和增殖、细胞运动和侵袭、细胞凋亡和抵抗化疗、放疗方面有重要作用。AKT的活化与肿瘤的发生发展密切相关,多种生长因子、激素、细胞因子、PTEN的失活和Ras的激活等均可刺激AKT的活化。近年来,关于活化的AKT与肿瘤的发生发展的研究取得了重大进展。近年来,许多学者发现PI3K/AKT信号传导通路异常改变与人类一些恶性肿瘤发生发展密切相关。研究发现,AKT活化的人类气管上皮细胞运动明显增强,细胞表现出转化细胞的特性,即丧失接触抑制和对ECM的黏附的能力。在具有高侵袭性的Lewis肺癌细胞系H259中使AKT的显性负突变体的过度表达,可减少细胞的侵袭性。用P13K特异性抑制剂LY294002或渥曼青霉素(Wortmannin)抑制AKT活性,在体外能减少神经胶质瘤细胞,卵巢癌细胞NoM1细胞系的侵袭性。也有一些研究揭示PI3K/AKT信号通路异常与一些肿瘤的转移有关,但其机制不清。AKT促进肿瘤细胞侵袭和转移的机制可能与以下因素有关：①AKT磷酸化eNOS(endothelialNOsynthase)的Ser1177/1179(牛/人),使之活化Dimmelers等观察到转染Ser1177磷酸化的eNOS可刺激上皮细胞转移,而转染Ser21177位点突变的eNOS(不具有被AKT磷酸化的能力)抑制VEGF诱导的上皮细胞的转移。其引起上皮细胞转移的机制近年来认为与eNOS活化导致NO产生,NO直接地上调ICAM的表达有关。②经过AKT/mTOR/P70S6k途径,P70s6k的活化促进肌动蛋白的细丝重构,促进细胞运动。③经PI3K/AKT/mTOR途径,上调MMP2mRNA和蛋白质表达。④活化的AKT能够增加NF-κF的转录活性,使MMP-9产量增加,且细胞运动增强,有助于癌细胞侵袭；NF-κB还能上调COX-2的表达,有助于细胞侵袭的发生。⑤AKT定位于移动的HT1080细胞最便于侵袭的细胞膜区域(leadinedge),说明活化的AKT具有细胞膜转位的能力,便于侵袭发生。⑥用表达构建的活性AKT转染的鳞状上皮细胞癌细胞系中,AKT驱使上皮间叶细胞转换,细胞获得纤维母细胞样特性,而且,E-钙黏素的转录下调,细胞间的黏附减少,增加了细胞的运动性和侵袭性。⑦AKT磷酸化GSK,拮抗β-cat的降解,胞浆中β-cat积聚使其浓度增高,下调E-钙黏素表达,促进细胞运动。⑧膜型1基质金属酶(membranetype matrixmetalloproteinase,MT1-MMP)是MMP-2的一个主要活化者。高侵袭性Lewis肺癌细胞系H259表达MT1-MMP,PI3K抑制剂LY294002和渥曼青霉素以及mTOR抑制剂rapamycin,AKT的显性负突变体的过度表达能够阻碍细胞MT1-MMP的表达,还可减少细胞的侵袭性。E-cadherin(E-cad)是一种分子量为120kD的跨膜单链多肽糖蛋白。E-cad与α-,β-,和γ-连还素(catenins)形成E-cad/cat复合体,参与调节组织发生与形态分化,对细胞的识别、迁移等行为发挥非常重要的作用,因此,其表达和功能状态直接影响肿瘤细胞的分离和附着。体内外大量研究均明E-cad的缺失与肿瘤的低分化、高侵袭、高转移、高复发率和耐药密切相关。E-cad具有肿瘤转移抑制的作用,现在认为E-cad基因具备了一个重要的肿瘤转移抑制基因的功能。目前很多研究揭示,E-cad表达下调或缺失是导致鼻咽癌转移的关键因素之一。除了E-cad表达下调可影响E-cad/cat复合体的功能,E-cad的表达部位也与其功能密切相关,在某些异常情况下可使细胞内骨架成分发生改变导致E-cad的不能定位于细胞膜而丧失其介导细胞黏附的功能,使细胞之间变的松散。除了具有重要黏附分子的功能以外,最近的研究还发现E-cad还与肿瘤的上皮-间叶转换(epithelial-mesenchymal transtion, EMT)密切相关。EMT是指上皮细胞向间叶细胞细胞表型转换,在此过程中上皮细胞失去极性,细胞-细胞及细胞-间质之间的黏附性发生改变,细胞内的肌动蛋白重排,最终细胞获得更强的迁移、侵袭和转移的能力。近年来,有关EMT与肿瘤转移的关系引起了学者的注意,是研究肿瘤转移的热点之一,而E-cad黏附性的改变是EMT的发生的前提和最重要的早期事件。目前的研究表明E-cad基因的改变受到多因素的影响,各种因素的作用错综复杂似是一个非常复杂网络系统,其中一些信号传导途径参与了这个过程。一些研究揭示PI3K/AKT细胞信号传导通路不仅与多种肿瘤的发生发展有关,而且与肿瘤EMT也密切相关,被认为是EMT过程中调节的中心环节。目前,国内外还没有检索到有关PI3K/AKT信号传导通路与鼻咽癌转移关系研究的文献,本研究的目的是从体内和体外系统的研究PI3K/AKT信号传导通路与鼻咽癌发生发展及其中EMT作用的关系,以及运用该通路的阻滞剂观察其是否能有效诱导鼻咽癌细胞的凋亡和抑制转移。为该通路的抑制剂应用于临床鼻咽癌的治疗,提供了初步的理论依据,为以后鼻咽癌的临床治疗提供了新的方法和思路。本研究分为两部分。第一部分研究内容主要、从临床的角度检测鼻咽炎组、鼻咽癌非转移组和转移组标本中AKT、pAKT (ser473)、E-cad蛋白的表达情况,目的是探讨它们与鼻咽癌发生发展的相关性,同时通过统计学分析上述指标之间的相关性,为后面的实验提供参考资料。同时检测其波形蛋白(Vimentin)和平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达情况,以探讨鼻咽癌转移是否与EMT具有相关性。第二部分,选择本教研室分离和保存的高浸润转移CNE-2Z鼻咽癌细胞系,首先应用Western-Blot方法检测其AKT、pAKT (ser473)和E-cad蛋白表达情况,然后应用P13K特异性抑制剂LY294002,以MTT法观察不同剂量LY294002对CNE-2Z细胞生长、增殖的作用；用免疫细胞化学分别检测CNE-2Z及不同剂量LY294002处理培养后的CNE-2Z细胞中AKT、pAKT (ser473)和E-cad蛋白的表达情况；RT-PCR检测不同剂量LY294002处理后的CNE-2Z细胞中E-cad mRNA的表达情况。ELISA法分别检测CNE-2Z及不同剂量LY294002处理培养后的CNE-2Z细胞中的磷酸化的AKT的含量；用体外细胞侵袭、运动实验检测LY294002处理培养后的CNE-2Z-细胞的侵袭和运动的改变。最后用CNE-2Z细胞接种裸鼠,1周后用不同剂量LY294002注射裸鼠腹腔内,观察各组裸鼠移植瘤生长、大小。用药4周后处死裸鼠,取每只裸鼠脏器和淋巴结观察转移的情况,同时保存移植瘤组织进行免疫组化、Western-Blot和TUNEL检测。结合两部分内容从临床、体内和体外实验结果综合分析鼻咽癌浸润转移与PI3K/AKT信号通路和EMT的关系及其机制,为今后肿瘤转移的治疗及药物的研发提供一个新的思路和靶点。[研究方法]第一部分：收集广东医学院附属医院和附属高州人民医院2004-2007年鼻咽癌患者130例,按WHO分类均为未分化型非角化性癌,其中53例经穿刺活检及免疫组化证实颈部淋巴结转移,其余77例在病理诊断鼻咽癌时影象学上没有发现局部浸润性改变和肿大的淋巴结。另外收集20例鼻咽黏膜慢性炎标本作为对照。所有的石蜡标本4μm连续切片,免疫组化检测AKT、pAKT (ser473)、E-cad、SMA和Vimentin的表达情况。由两位病理医师分别独立对实验结果进行双盲法评估。每一切片随机选择5个视野(×100),在显微镜(×400)下计数每个视野100个肿瘤细胞中阳性细胞的比例,非癌组织则计数着色区100个细胞中阳性细胞的比例,取5个视野的平均百分数为判定结果。光学显微镜下观察,根据棕黄色阳性信号的强弱和面积判断结果：阳性细胞<10%为阴性表达；10%-50%为阳性表达；>50%为强阳表达。结果判断：按阳性细胞百分率计分：阳性细胞≤10%计0分；11%-50%计1分；>50%计2分。(2)按染色强弱计分：淡黄色计0分；黄色计1分；棕黄色计2分。两项合并得0-1分为阴性；2-3分为阳性；4分为强阳性。(3)0分和1分均记为—；2分记为+；3分记为++；4分记为+++。第二部分：选择广东医学院分离和保存的高浸润转移CNE-2Z鼻咽癌细胞系进行细胞培养,然后应用P13K特异性抑制剂LY294002,以MTT法观察不同剂量LY294002对CNE-2Z细胞生长、增殖的作用；RT-PCR检测不同剂量LY294002处理后的CNE-2Z细胞E-cad的表达情况。ELISA法分别检测CNE-2Z及不同剂量LY294002处理培养后的CNE-2Z细胞中的磷酸化的AKT的含量；用体外细胞侵袭、运动实验检测LY294002处理培养后的CNE-2Z-细胞的侵袭和运动的改变。最后用CNE-2Z细胞接种裸鼠,1周后用不同剂量LY294002注射裸鼠腹腔中,观察各组裸鼠移植瘤生长、大小。第5周处死裸鼠,取每只裸鼠脏器和淋巴结观察转移的情况,同时保存移植瘤组织进行免疫组化、Western-Blot和TUNEL检测。白的阳性表达分别为30%(6/20)、25%(6/20)、100%(20/20)和77.7%(101/130)、68.5%(89/130)、75.4%(98/130)。鼻咽慢性炎组和鼻咽癌组之间AKT、pAKT和E-cad的表达在统计学上有显著性差异(P<0.05；P<0.01)。鼻咽癌转移组和非转移组间的pAKT、E-cad、Vimentin和SMA的表达在统计学上有显著性差异(P<0.05;P<0.01)。鼻咽癌原发灶与其配对淋巴结转移灶中E-cad和Vimentin的阳性表达在统计学上有显著性差异(P<0.05),其它指标未见明显的统计学差异。2、转移组中鼻咽癌pAKT (ser473)阳性表达与E-cad的表达呈负相关,相关系数为：r=-0.368,P=0.007,P<0.01。非转移组中,AKT、pAKT与E-cad的表达呈负相关,相关系数分别为：r=-0.294, P=0.010, P<0.05;:r=-0.494, P=0.000, P<0.01。转移组中,Vimentin、SMA与E-cad的表达呈负相关,相关系数分别为：r=-0.448, P=0.001, P<0.01; r=-0.738, P=0.000, P<0.01。非转移组中,Vimentin、SMA与E-cad的表达呈负相关,相关系数分别为：r=-0.356, P=0.001, P<0.01; r=-0.334, P=0.003, P<0.01。3、PI3K/AKT信号传导通路通过诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞E-cad蛋白水平的下降及Vimentin、SMA活性上升,具有上皮-间质细胞样转化作用。4、MTT法观察PI3K抑制剂LY294002对CNE-2Z细胞生长、增殖具有抑制作用,而且呈剂量依赖关系。应用流式细胞术发现,在培养的CNE-2Z细胞中加入LY294002后,CNE-2Z细胞的凋亡明显增加并呈剂量依赖关系,而在加入应用caspase-9的阻滞剂ZVAD后,其凋亡明显下降。5、免疫细胞化学实验中,LY294002作用后CNE-2Z细胞的pAKT的蛋白表达减弱,E-cad蛋白表达增强。6、ELISA法分别检测不同剂量LY294002可以抑制CNE-2Z细胞中的磷酸化的AKT的含量并呈剂量依赖关系。7. RT-PCR方法显示不同剂量LY294002可以增加CNE-2Z细胞E-cad mRNA的表达水平。8、在体外细胞侵袭、运动实验中,LY294002明显抑制CNE-2Z-细胞的侵袭和运动能力。9、Western-Blot和免疫组织化学方法显示不同剂量LY294002引起CNE-2Z细胞pAKT (S473)蛋白明显下降,而AKT蛋白水平无明显变化,E-cad蛋白的表达增强。同时发现caspase-9蛋白表达上调,在加入caspase-9的阻滞剂ZVAD后,其蛋白表达无明显改变。10、应用不同剂量LY294002注射各组荷瘤裸鼠腹腔4周后发现,50mg/kg和75mg/kg组肿瘤体积明显小于对照组、10mg/kg及25mg/kg组,它们之间比较在统计学上有显著性差异(p<0.05；p<0.01)。11、应用不同剂量LY2940024周后处死所有的荷瘤裸鼠,取裸鼠所有的脏器和淋巴结作病理切片,肉眼没有发现脏器有肿物存在和淋巴结肿大,通过切片观察发现对照组中3只裸鼠肺有微小转移,10mg/kg和25mg/kg组各有1只裸鼠有微小肺转移,而50mg/kg和75mg/kg组没有发现任何转移灶。12、各组裸鼠移植瘤组织HE切片显示、免疫组化、TUNEL和Western-Blot检测发现对照组裸鼠移植瘤组织坏死区域小,增殖指数高,凋亡率低,而治疗组与对照组裸鼠移植瘤比较,其瘤组织坏死区域大,增殖指数低,凋亡率高,同时免疫组化和Western-Blot检测结果显示治疗组pAKT (S473)蛋白明显下降,AKT蛋白水平无明显变化,Vimentin和SMA的表达明显下调,caspase-9蛋白的表达明显上调,尤其是50mg/kg和75mg/kg治疗组,它们之间比较在统计学上有显著性差异(p<0.05；p<0.01)。[结论]1、转移组和非转移组鼻咽癌中pAKT (ser473)、E-cad、SMA和Vimentin的阳性表达率具有显著的差异；转移组鼻咽癌原发灶与其配对颈部淋巴结转移灶中E-cad和Vimentin阳性表达率有显著性差异。2、PI3K抑制剂LY294002可以抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞生长、增殖及通过caspase-9途径诱导其发生凋亡3.PI3K/AKT信号传导通路通过诱导鼻咽癌CNE-2Z发生上皮-间质细胞样转化(EMT)促进其侵袭和转移。4、PI3K/AKT信号传导通路抑制剂LY294002通过增加CNE-2Z细胞E-cad蛋白的表达,具有间叶-上皮转换(MErT)样的作用,降低了其侵袭和运动能力及抑制了裸鼠移植瘤的转移。5、PI3K特异性的抑制剂LY294002作用的实验结果,可能为鼻咽癌及其它肿瘤转移的机制的研究和相关新药物的研发提供新的思路和启示。