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大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病,是大豆生产中的一种毁灭性病害,平均每年给全世界大豆生产造成10-20亿美元的经济损失。大豆疫霉在侵染大豆的过程中会分泌大约400个RxLR(Arg-any amino acid-Leu-Arg)效应分子,这些效应分子在病原菌侵染寄主的过程中发挥着重要的作用。有些效应分子能够诱发植物产生免疫反应,有些效应分子则会抑制植物产生的免疫反应,这些效应分子程序性表达、协同作用帮助病原菌致病。基于本实验室前期的研究发现大豆疫霉菌分泌的RxLR效应分子PsAvh52能够抑制PMAPs(INF1和XEG1)和效应分子(PsAvh238和PsAvh241)引起的细胞坏死。本研究在此基础上对PsAvh52的毒性功能作了进一步的探索,鉴定到了其在寄主中的靶标蛋白GmTAP1,揭示了 PsAvh52促进大豆疫霉侵染的分子机制。大豆疫霉RxLR效应分子PsAvh52毒性功能分析。本实验研究发现在大豆疫霉侵染前期,分泌的一个高表达的RxLR效应分子PsAvh52,是大豆疫霉全毒力必需的效应分子。PsAvh52在四个代表大豆疫霉生理小种的菌株间存在着序列的多态性,有7个正向选择位点,属于较多位点的序列变异。这表明PsAvh52在发挥毒性功能的同时,面临着巨大的寄主选择压力,导致基因发生变异。利用SMART对PsAvh52蛋白序列分析发现,PsAvh52除了 RxLR效应分子具有保守的SP(signal peptide)和RxLR-dEER结构域外,在蛋白的C端还有一个典型的核定位信号NLS(nuclear localization signal)结构域。在大豆根毛和烟草中表达PsAvh52,发现其定位在植物的细胞核中,这说明PsAvh52在植物的细胞核中发挥功能。过表达PsAvh52-RFP的大豆疫霉侵染大豆,发现在侵染前期PsAvh52-RFP向大豆疫霉的吸器中聚集。敲除大豆疫霉PsAvh52基因,大豆疫霉侵染大豆的致病力减弱;在大豆根毛和烟草中过表达PsAvh52,能够促进疫霉菌的侵染。通过在烟草上表达PsAvh52及其突变体后接种辣椒疫霉筛选PsAvh52发挥毒性功能必需区域的实验发现PsAvh52的核定位信号(NLS)以及69-86位的氨基酸是其发挥毒性功能必需的结构域。以上结果说明PsAvh52是大豆疫霉侵染过程中一个必需的效应分子,在大豆疫霉致病过程中起着非常重要的作用。PsAvh52在大豆中靶标蛋白的鉴定及靶标蛋白的功能分析。在大豆根毛和烟草中表达PsAvh52能够促进疫霉菌的侵染,这表明PsAvh52作为一个毒性因子帮助大豆疫霉菌的侵染。为了进一步解释PsAvh52发挥毒性的分子机制,我们对PsAvh52在寄主中靶标蛋白做了鉴定,进一步阐述其干扰寄主免疫反应的分子机制。我们通过Co-IP以及LC-MS/MS鉴定到了效应分子PsAvh52在大豆中的互作蛋白GmTAP 1。用体内Co-IP以及体外Pull-down的方法证明了 PsAvh52能够与GmTAP1互作。PsAvh52不能与GmTAP1同源蛋白GmTAP2互作,这表明PsAvh52与GmTAP1发生特异性的互作。此外,GmTAP1与GmTAP2的生物学功能也存在着差异:(1)GmTAP1定位于植物的细胞质中,然而GmTAP2定位于植物的细胞核和细胞质中。(2)当GmTAP1作为一个免疫负调节子,调控着大豆应对大豆疫霉侵染时的免疫反应,但GmTAP2不影响植物抵抗疫霉菌时的免疫反应。TAP蛋白在植物中存在,但不存在于动物中。植物中TAP蛋白的C端具有非常的保守的乙酰转移酶的酶活结构域,但这些蛋白N端存在着差异。对GmTAP1在大豆以及拟南芥中的同源蛋白功能分析发现,N端的差异导致了这些蛋白功能的不同。总之,效应分子PsAvh52的互作蛋白GmTAP1具有乙酰转移酶的活性,在大豆疫霉与大豆互作的过程中负调控着植物的免疫。PsAvh52调控GmTAP1介导的植物免疫反应机制研究。大量的证据表明包括组蛋白乙酰化在内的表观遗传修饰在植物与病原菌互作过程中是调控植物免疫重要的途径之一。然而针对植物病原菌分泌的效应分子操控寄主的表观遗传修饰促进侵染的研究还相对较少。通过本研究发现,PsAvh52与GmTAP1互作后,使GmTAP1定位发生改变:从细胞质重新定位到细胞核中。PsAvh52的NLS突变体PsAvh52M1以及缺失了 69-86位氨基酸的突变体PsAvh52M4不能使GmTAP1的定位发生从细胞质到细胞核定位的改变,同时这两个突变体也失去了毒性功能。这些结果说明PsAvh52的NLS和69-86位氨基酸的结构域是其改变GmTAP1的定位,进而发挥毒性功能所必须的。此外,定位于细胞核的GmTAP1能增加H2AK5和H3K9乙酰化提高植物感病基因的表达促进植物感病,这一过程需要GmTAP1的组蛋白乙酰转移酶活性。总之,PsAvh52通过招募GmTAP1进入细胞核,增加组蛋白的乙酰化,调控表观遗传修饰促进植物感病。