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PEF(Penta EF Hand)家族蛋白是具有五个连续的EF-hand motif的一类蛋白,已有的研究表明PEF家族可以通过其EF hand结构域与钙离子结合,感应胞内钙离子浓度变化并引发一系列功能应答,从而在细胞的各项生命活动中发挥重要作用。其中,人类的ALG-2蛋白就是一个进化上十分保守的PEF蛋白,其同源蛋白也存在于进化程度高、低不等的很多物种中。在哺乳动物系统中,ALG-2对于正常细胞分裂是必需的,且参与调节了内质网胁迫刺激引发的细胞凋亡。酵母中ALG-2的同源蛋白Peflp具有调节其对低钙环境的响应及出芽位点的选择。烟曲霉是广泛存在于自然环境中,能引发免疫缺陷病人发生侵袭性曲霉病的病原。在临床上烟曲霉是仅次于白念珠菌的一种重要的条件致病真菌。我们的信息学分析发现烟曲霉中也存在ALG-2的同源蛋白PefA,其氨基酸序列与人类ALG-2有39%的相同性(Identity),与酿酒酵母Peflp有28%相同。信息学分析PefA中也存在连接钙离子的五个EF-hand结构域,但目前还不知道PefA基因在烟曲霉乃至其它病原真菌中的功能。本文系统探究了 PEF蛋白PefA在烟曲霉中的生理功能,并研究其与烟曲霉对唑类药物抗性的关系。本课题利用融合PCR及绿色荧光蛋白标记技术构建了 PefA敲除菌株Grs01,PefA回补菌株Grs02及自生启动子调控下的PefA-GFP荧光标记菌株Grs03。通过观察Grs01及Grs02前后表型的变化发现PefA的缺失导致了烟曲霉对伊曲康唑(ITZ)的抗性增强。进而,采用HPLC的方法检测的唑类药物药靶麦角固醇含量及用罗丹明荧光探针(Rhodamine 123)模拟唑类药物作为药泵底物来进行药物外排泵活力的检测,均未发现Grs01与野生型菌的麦角固醇含量和药泵活力的差异,说明缺失菌对于唑类药物产生的耐受性增强特征不是由于通过改变药靶合成和药泵的活力而进行的。荧光显微镜下观察PefA-GFP荧光标记菌株,发现PefA均匀分布在胞质中,而不存在细胞核内。令人感兴趣的是,在高浓度ITZ药敏板上涂布等量的Grs01与野生型孢子培养后统计存活率,Grs01存活率明显高于野生型菌株,且在高浓度ITZ环境中存活下来的PefA敲除菌对VRC(伏立康唑)、MCZ(咪康唑)也产生了抗性,并且这种耐药性在其后代中是稳定遗传的。本论文的创新点在于系统、全面地阐明和揭示了PefA在烟曲霉中的功能,发现PefA与烟曲霉对唑类药物多药耐药具有关联性,本研究为进一步解释临床上乃至自然界唑类药物耐药菌株产生提供了部分理论依据。