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肝细胞癌(以下简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,因其高发病率、高复发转移率及高死亡率,也已成为一种威胁人民生命健康极常见的恶性肿瘤之一。肝癌患者的术后复发转移一直是遏制肝癌预后改善的关键问题。因此,深入研究肝癌复发转移的分子机制并积极探索有效的抗复发转移的治疗手段,对于进一步改善肝癌患者的长期存活率具有重要意义。ELMO1(engulfinent and cell motility protein1)是新近发现的一类跨膜蛋白。近年来的研究发现ELMO1与Dock180形成复合物,然后激活Rac1,而Rac1蛋白在促进细胞的吞噬运动中发挥着关键的作用,这提示ELMO1可能在肿瘤的侵袭转移中发挥了重要作用。衔接蛋白(adaptor protein, Nck)是WASP家族蛋白的一个重要的结合蛋白。Nck可以引起ELMO1的酪氨酸磷酸化,而ELMO1在调控细胞运动能力方面有着强大功能,这提示ELMO1可能通过同Nck相互的酪氨酸磷酸化作用参与肝癌侵袭转移过程,但其具体作用机制目前尚不清楚。本课题首先在肝癌组织、癌旁肝硬化组织及正常肝组织标本中检测ELMO1表达情况并比较各组间的表达差异。进而通过RNA干扰技术,抑制肝癌细胞系HCCLM3细胞中ELMO1的表达水平,并综合利用一系列分子生物学和细胞生物学的方法研究ELMO1调控肝细胞癌侵袭转移的作用及分子机制。第一童ELMO1在正常肝、肝硬化及肝癌中的表达情况目的了解ELMO1在正常肝组织、癌旁肝硬化组织及肝癌组织中表达情况的差异方法(1)免疫组化检测57例肝癌组织、57例癌旁肝硬化组织及15例正常肝组织中ELMO1蛋白的分布情况及阳性表达率。(2)实时荧光定量PCR (qRT-PCR)及Western blotting方法分别检测ELMO1mRNA和蛋白在57例新鲜肝癌组织及其配对的癌旁肝硬化组织中的表达水平,15例新鲜正常肝组织作为对照。结果(1)免疫组化法检测结果显示,ELMO1阳性表达主要定位于肝癌细胞浆内,肝癌石蜡组织中的ELMO1蛋白阳性表达率及阳性评分均数明显高于癌旁肝硬化组织和正常肝组织(P<0.05)。而癌旁肝硬化组织和正常肝组织两者之间,ELMO1阳性表达情况无显著性差异。(2) qRT-PCR和Western blotting检测结果分别显示,肝癌新鲜组织中ELMO1mRNA和蛋白表达水平均明显高于癌旁肝硬化组织和正常肝组织,差异均具有显著性(尸<0.05)。而癌旁肝硬化组织和正常肝组织之间,ELMO1mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义。结论ELMO1基因在肝癌组织中均高表达；而在癌旁肝硬化和正常肝组织中均呈低表达,且两者表达水平无明显差异。第二章RNA干扰抑制ELMO1基因表达对肝癌细胞生物学行为的影响目的探讨RNAi技术抑制肝癌细胞中ELMO1表达对肝癌细胞生物学行为的影响方法(1)构建、鉴定逆转录病毒干扰质粒pSUPERELMO1RNAi+和无效对照组质粒pSUPERELMO1RNAi-,分别感染PT67病毒包装细胞,获得重组逆转录病毒颗粒后,再转染HCCLM3肝癌细胞。(2) Western blotting检测L02正常肝细胞和HCCLM3肝癌细胞亚株中ELMO1蛋白表达量。(3)细胞粘附实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验分别比较HCCLM3ELMO1RNAi+和HCCLM3ELMO1RNAi-两组细胞的粘附、迁移、侵袭能力。(4)细胞免疫荧光比较HCCLM3ELMO1RNAi+和HCCLM3ELMO1RNAi-两组细胞形态及运动伪足。(5)MTT、克隆形成实验和流式细胞技术比较HCCLM3ELMO1RNAi+和HCCLM3ELMO1RNAi-两组细胞增殖凋亡能力。结果(1)达到满意的转染效率,并通过筛选成功获得ELMO1稳定表达沉默的HCCLM3ELMO1RNAi+和无效对照的HCCLM3ELMO1RNAi-细胞亚株。(2) Western blotting方法检测结果显示,HCCLM3ELMO1RNAi-细胞中的ELMO1蛋白表达量明显高于L02正常肝细胞及HCCLM3ELMO1RNAi+细胞(P<0.05),并且HCCLM3ELMO1RNAi+组抑制效率明显高于HCCLM3ELMO1RNAi-组。(3)粘附实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验结果显示,HCCLM3ELMO1RNAi+细胞较HCCLM3ELMO1RNAi-细胞的同质性粘附能力明显增强而异质性粘附能力明显减弱,细胞迁移、侵袭能力明显下降,差异均具有显著性(P<0.05)。(4)细胞免疫荧光检测结果显示,HCCLM3ELMO1RNAi+和HCCLM3ELMO1RNAi-丙组细胞形态及运动伪足存在显著差异(P<0.05)。(5)MTT法、克隆实验和流式细胞技术检测结果显示,HCCLM3ELMO1RNAi+和HCCLM3ELMO1RNAi-两组细胞的增殖和凋亡能力无显著性差异(P>0.05)。结论体外抑制ELMO1的表达水平可显著抑制肝癌细胞的侵袭转移能力,但并不影响肝癌细胞的增殖和凋亡能力。第三章ELMO1调控肝细胞癌侵袭转移的分子机制研究目的探讨ELMO1和Nck酪氨酸磷酸化的作用位点及调控肝癌细胞侵袭转移的分子机制方法(1) Western blotting方法分别检测HCCLM3ELMO1RNAi+与HCCLM3ELMO1RNAi-两组细胞中Rac1、Fibronectin和Nck蛋白表达水平。(2)构建ELMO1的野生型质粒(pcDNA-HA-ELMO1)和突变体质粒(pcDNA-HA-ELMO1-Y18F、Y216F、Y395F、Y511F、Y720F)转染HCCLM3ELMO1RNAi+与HCCLM3ELMO1RNAi-两组细胞。(3)免疫共沉淀技术及Western blotting方法,鉴定ELMO1与Nck酪氨酸磷酸化的作用位点。结果(1) Western blotting检测结果显示,HCCLM3ELMO1RNAi+细胞中Rac1与Nck蛋白表达水平均明显低于HCCLM3ELMO1RNAi-细胞中表达水平；而HCCLM3ELMO1RNAi+细胞中Fibronectin蛋白表达水平明显高于HCCLM3ELMO1RNAi-细胞,差异均具有显著性(P<0.05)。(2)免疫共沉淀及Western blotting结果发现并证实,ELMO1蛋白的Y720F位点是ELMO1与Nck酪氨酸磷酸化的作用位点。结论(1)沉默ELMO1表达将会同时下调Rac1和Nck的表达水平而上调Fibronectin的表达水平,这可能是调控肝癌细胞侵袭运动和粘附作用的重要机制。(2) ELMO1的Y720F位点调节ELMO1-Nck的酪氨酸磷酸化。(3) ELMO1-Nck信号传导通路在肝癌细胞运动的调控中可能发挥了重要作用,有望成为抗肝癌复发转移的潜在药物靶点。