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目的： 为研究大肠杆菌中CyaY蛋白的功能，通过同源重组技术敲除大肠杆菌中编码这个蛋白的基因cyaY以及与其有相互作用的编码SodA和SodB蛋白的sodA和sodB，得到sodA-sodB-cyaY-基因缺失的三突变株，再将cyaY基因导入sodA-sodB-cyaY突变株中，在不同的条件下测定这些构建菌株的生长状态，为CyaY蛋白的功能研究提供实验基础。 方法： 1.大肠杆菌sodAsodB cyaY突变株的构建 1)打靶载体的制备根据哈佛大学网站提供的基因敲除的引物序列，送大连宝生物公司合成，通过两步交叉PCR反应，扩增出三个基因的读码框缺失片段sodA-、sodB-cyaY-克隆到低拷贝、条件复制基因敲除质粒工具pKOV内的NotⅠ、SalⅠ双酶切位点中，构建两个基因打靶载体:pKOV-sodA-、pKOV-sodB-、pKOV-cyaY-。 2) sodA、sodB和cyaY单个基因的敲除利用已构建好的打靶载体pKOV-sodA-、pKOV-sodB-、pKOV-cyaY-进行soda基因、sodB基因和cyaY基因的敲除。其敲除流程是:a）使用质粒小量提取试剂盒，从含有打靶载体pKOV-sodA-、pKOV-sodB-和pKOV-cyaY-的大肠杆菌DH5α中提取纯度较高的打靶载体pKOV-sodA-、pKOV-sodB-和pKOV-cyaY-;b）通过冷氯化钙法转化重组频繁的大肠杆菌株MC4100;c）经过转化的大肠杆菌涂布于氯霉素/LB平板并置42℃孵育，平板上存活的菌落表明重组pKOV质粒已成功整合进入基因组DNA，因为游离质粒不会在非允许温度下复制增殖;d）存活的菌落立即被置于含5％(w/v)蔗糖的LB平板上置30℃培养以选择发生第二次重组的大肠杆菌克隆。对蔗糖有抗性且对氯霉素敏感的细菌克隆被挑选出来，用作进一步分析，所选克隆通过针对目的基因sodA、sodB和cyaY两侧序列引物的PCR方法进行筛选，如果敲除成功，PCR扩增出不含基因soda、sodB和cyaY读框的片段，相反，扩增出与亲代一样的片段，证实敲除不成功。 3) sodA和sodB两个基因的敲除通过同样的敲除流程，在soda突变株基础上敲除sodB，得到soda和sodB两个基因缺失的突变株sodA-sodB-。 4) sodA和cyaY两个基因的敲除通过同样的敲除流程，在sodA突变株基础上敲除cyaY，得到soda和cyaY两个基因缺失的突变株sodA-cyaY-。其中，敲除流程和原来不同之处是:第二次同源重组条件改为，含5％（w/v）蔗糖的LB平板置30℃厌氧培养，其它条件不变。 5) sodB和eyaY两个基因的敲除通过同样的敲除流程，在sodB突变株基础上敲除cyay，得到sodB和cyaY两个基因缺失的突变株sodB-cyaY-。其中，敲除流程和原来不同之处是:第二次同源重组条件改为，含5％(w/v)蔗糖的LB平板置30℃厌氧培养，其它条件不变。 6) sodA、sodB和cyaY三基因的敲除通过同样的敲除流程，在sodAsodB突变株基础上敲除cyaY，得到sodA、sodB和cyaY三个基因缺失的突变株sodA-sodB-cyaY-。其中，敲除流程和原来不同之处是:第二次同源重组条件改为，含5％(w/v)蔗糖的LB平板置30℃厌氧培养，其它条件不变。 2.cyaY基因的导入 以野生型大肠杆菌MC4100的基因组为模板，用PCR方法分别扩增出cyaY基因，PCR产物经限制性内切酶NcoⅠ，EcoRⅠ双酶切，然后克隆入表达载体pBAD构建重组质粒pBAD-cyaY。将重组质粒pB AD-cyay转化到sodA-sodB-cyaY-三突变株，构建菌株pBAD-cyaY/sodA-sodB-cyaY-。 3.构建菌株生长状态测定 分别测定这些构建菌株的生长状态。 结果： 1.大肠杆菌sodAsodB cyaY三突变株的构建利用打靶载体pKOV-sodA-、pKOV-sodB-、pKOV-cyaY-获得sodA-单突变株，sodB-单突变株，cyaY-单突变株和及sodA-cyaY-、sodB-cyaY-、sodA-sodB-cyaY-突变株;PCR鉴定经琼脂糖凝胶电泳可见约1kp的目的条带。 2.cyaY基因的导入利用表达载体pBAD将cyaY导入到sodA-sodB-cyaY-突变株中，得到菌株pBAD-cyaY/sodA-sodB-cyaY-。PCR鉴定经琼脂糖凝胶电泳可见约300bp的目的条带;测序结果证实基因序列正确。 3.构建菌株生长状态测定通过以野生型大肠杆菌MC4100作为对照测定生长曲线，结果显示，在生理状态及氧化应激状态下对cyaY单突变菌株生长没有显著性区别;分别通过以soda，sodB单突变菌株作为对照测定生长曲线，结果显示，在生理状态及氧化应激状态下对sodAcyaY, sodBcyaY双突变菌株生长也没有显著性差异;而通过以sodAsodB双突变菌株作为对照测定生长曲线，结果显示，在生理状态及氧化应激状态下对sodAsodBcyaY突变菌株出现了显著性的区别，而pBAD-cyaY/sodAsodBcyaY突变菌株在氧化应激的状态下，可以恢复生长。 结论： 利用基因敲除技术成功获得sodA，sodB和cyaY单突变菌株，sodAsodB，sodAcyay，sodBcyaY双突变菌株以及sodAsodBcyaY三突变菌株。sodAsodB和sodAsodBcyaY在生理状态下，其生长状态没有显著性的差异;而在氧化应激的状态下，一定浓度的sodAsodB双突变菌株可以长出来，而相对应浓度的sodAsodBcyaY突变株却没有长出来;而在sodAsodBeyaY突变菌株中导入cyaY后，在氧化应激的状态下，可以恢复生长。说明CyaY在氧化应激的状态下是铁的伴侣分子，与形成铁硫簇有关。