在养蜂生产中,花粉的充足供应是工蜂咽下腺发育的重要保证。同时,人们也时常发现,幼虫的存在刺激着工蜂咽下腺的发育。也就是说,花粉供应是否充足(营养因素),以及蜂巢内是否存在幼虫(幼虫诱导),是影响工蜂咽下腺发育的二大重要因素。迄今为止,营养和幼虫诱导对蜜蜂咽下腺发育的分子调节机制仍不清楚。本研究以意大利蜜蜂为试验对象,以营养和幼虫诱导为试验因子,利用组织细胞学、分子生物学和生物信息学技术探索其对咽下腺发育的分子调控机制,为阐明工蜂泌浆的分子机制奠定基础。主要研究内容及结果如下:1.营养和幼虫诱导对意大利蜜蜂咽下腺发育的影响为探究营养和幼虫诱导对蜜蜂咽下腺发育的影响,试验选取健康、群势一致的姐妹蜂王群9群,随机分为3个组,每组3个重复,每个重复1群蜂。1个组饲喂蜂蜜(honey),命名为Hon组,作为对照组;1个组饲喂蜂蜜和花粉(pollen),命名为Pol组;1个组在饲喂蜂蜜和花粉的同时,以幼虫(brood)诱导,命名为Bro组。试验期间,各组提供充足的蜂蜜或花粉,试验期为12天。试验第1天标记足量新出房工蜂,分别于试验的第6天、9天、12天采集被标记蜜蜂。采用BCA试剂盒测定第6、9、12天被标记蜜蜂咽下腺组织蛋白含量;利用透射电镜观察第9天被标记蜜蜂咽下腺细胞的超微结构;应用IlluminaHiSeqTM 2500双末端测序技术测定第9天被标记蜜蜂咽下腺总RNA转录水平。结果如下:(1)Bro组、Pol组和Hon组的工蜂咽下腺组织蛋白含量在各日龄差异极显著,均是以9日龄最高,6日龄最低(P<0.01);同时发现9日龄工蜂咽下腺蛋白含量在3组中差异极显著,Bro组>Pol组>Hon组(P<0.01)。(2)超微结构结果发现,Bro组和Pol组咽下腺细胞内粗面内质网多呈长管状或小泡状,其外表面附有大量核糖体,而Hon组粗面内质网腔很窄、其外表面附着核糖体较少;各组咽下腺细胞胞内分泌管体积依次为:Bro组>Pol组>Hon组。(3)采用生物信息学分析转录结果,共检测到7种可变剪切类型,累计SNP位点数达87792个;共发现新基因360个,其中有230个注释到COG、GO、KEGG等数据库中;共检测到2,801个差异表达基因,其中Hon组和Pol组、Hon组和Bro组、Pol组和Bro组间的差异基因个数为220、2,380、1,658,分别有213、2328、1617个注释到各类数据库中;途径富集分析表明,与幼虫诱导相关的基因主要参与了氧化磷酸化生物过程和Wnt信号通路,营养特异基因主要参与了过氧化物酶体、果糖和甘露糖的代谢活动,而花粉和幼虫诱导共同作用的特异基因主要参与了核糖体蛋白、氧化磷酸化和tor信号通路及支链氨基酸代谢过程;特别关注了9个mrjps基因,对mrjps基因进行聚类分析,发现mrjp4和mrjp7、mrjp5和mrjp8是功能相近的两组基因。2.候选基因的功能分析及验证为了挖掘调控咽下腺发育的重要基因,我们首先采用维恩分析比较了试验一中hon组、pol组和bro组两两之间的共同差异基因,共发现36个,其中mrjp2、mrjp3、loc724114和loc410337受花粉和幼虫的叠加诱导,表达水平升高幅度较大,因此我们以这4个基因作为我们的目的基因,对其进行功能分析及验证分析。试验采集新出房工蜂1980只,随机分为6组(a组、b组、c组、d组、e组、f组),每组3个重复,每个重复110只蜜蜂,于室内蜜蜂饲养盒中饲养,试验期为15天。a组饲喂蜂蜜;b组饲喂蜂蜜和油菜花粉;c组饲喂蜂蜜和油菜花粉,并将一块带有小幼虫的巢脾放入饲喂盒内,以诱导蜜蜂哺育;d组前9天饲喂蜂蜜,后6天饲喂蜂蜜和油菜花粉;e组前9天饲喂蜂蜜,后6天饲喂蜂蜜和油菜花粉,并用具小幼虫巢脾诱导;f组前9天饲喂蜂蜜和油菜花粉,后6天在饲喂蜂蜜和油菜花粉的基础上,用小幼虫诱导。首先,a(hon)、b(pol)、c(bro)三组在饲养的第1、3、6、9和12天各取10只蜜蜂解剖,分离其头部、胸部肌肉、腹部表皮、中肠和毒腺5个部位,提取各部位总rna,采用qrt-pcr方法测定目的基因在不同发育时期和不同组织部位的表达水平。其次,在饲养的第9天,a、b、c组每盒取30只蜜蜂;第15天,a、b、c、d、e、f组每盒取30只蜜蜂;解剖分离蜜蜂咽下腺,提取总rna,测定目的基因mrna表达水平。结果表明:(1)花粉+幼虫诱导基因loc724114和loc410337在9日龄头部和中肠中高表达;而基因mrjp2和mrjp3主要在9日龄工蜂头部、肌肉和表皮中表达;(2)loc724114、loc410337、mrjp2和mrjp3在花粉和花粉+幼虫的诱导下,均是在9日龄具有高表达,到15日龄时,表达量显著降低(p<0.01);(3)基因loc410337和loc724114主要受花粉+幼虫的共同调控作用;而mrjp2和mrjp3受花粉和幼虫的叠加调节作用。本研究表明,营养和幼虫诱导刺激咽下腺细胞内各种细胞器增多,提高了其合成组织蛋白的能力,促进工蜂咽下腺的发育;营养和幼虫诱导影响工蜂咽下腺基因组的转录。营养和幼虫诱导下的degs,主要通过在ribosome通路中正调控作用和在tor、wnt信号通路中的负调控作用共同影响工蜂咽下腺的发育;花粉(营养)是咽下腺发育的必需营养物质,幼虫的存在是促使咽下腺发育的关键诱因,营养和幼虫诱导是调控咽下腺发育的两种关键因素。