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病原菌在感染宿主的过程中必须具有快速适应各种环境压力的能力,这对于胞内病原菌来说尤为重要。结核分枝杆菌和牛分枝杆菌属于两种典型的胞内致病菌,它们在感染宿主的过程中不可避免会遇到诸如缺氧、贫营养等多种恶劣环境压力。已有大量研究表明,细菌第二信使分子环二鸟苷酸单磷酸（Cyclic di-GMP,简称c-di-GMP）在细菌多种重要生理过程及逆境存活中发挥广泛调控作用,它常常通过特异性转录因子受体驱动细菌对各种环境压力的适应。但是,目前关于c-di-GMP信号分子是否在分枝杆菌等胞内菌面临缺氧压力下也发挥调控功能及相关调控通路等尚不清楚。本研究以牛分枝杆菌BCG菌株作为模式菌株,首次发现并系统解析了c-di-GMP信号分子通过一个新的受体转录因子Arg R驱动分枝杆菌在缺氧条件下存活的新机制。取得的具体结果如下:（1）缺氧压力显著诱导BCG菌株胞内c-di-GMP含量增加,c-di-GMP在细菌胞内的积累进一步促进分枝杆菌在缺氧条件下的存活能力。利用高效液相色谱检测了菌株在有氧培养和缺氧培养条件下的胞内c-di-GMP水平,发现BCG细菌胞内c-di-GMP含量在缺氧压力下增加至有氧培养条件下的3.2倍。通过比较测定不同c-di-GMP水平菌株的BCG菌株在缺氧条件下的生长差异,发现缺氧条件下高c-di-GMP含量的细菌存活数量第4天和第6天分别增加至对照菌株的2.69倍和2.75倍。因此,细菌胞内c-di-GMP的积累能够显著增加BCG在缺氧压力下的存活。（2）c-di-GMP正调控精氨酸合成基因簇arg C-H和硝酸盐呼吸相关基因簇nar K2-X的表达。通过细菌转录组比较分析了高c-di-GMP水平菌株与对照菌株在缺氧条件下的基因表达差异,发现共有353个基因的表达发生了显著的变化,其中精氨酸合成基因簇arg C-H和以前报道的一个与分枝杆菌缺氧反应相关的硝酸盐呼吸相关基因簇nar K2-X都在高c-di-GMP水平菌株中显著上调。进一步在BCG菌株中超表达arg C-H基因簇并检测其在缺氧压力下的存活,发现超表达菌株的活菌数增加至野生型菌株的2.32倍,这表明精氨酸合成基因簇arg C-H在BCG菌株缺氧适应中发挥重要功能。（3）Arg R是一个新的c-di-GMP受体,c-di-GMP与Arg R相互作用解除其对arg C-H的抑制作用,导致细菌胞内精氨酸合成增加、谷氨酸积累减少。精氨酸代谢基因簇arg C-H编码从L-谷氨酸合成L-精氨酸的多种酶,Arg R作为一个抑制子负调控arg C-H基因簇的表达。通过紫外交联和等温滴定量热（ITC）实验,我们证实转录因子Arg R是一个新的c-di-GMP受体,其与c-di-GMP结合的结合常数Kd为0.341±0.05μM,化学计量比为1:1。通过凝胶阻滞实验、表面等离子共振、半定量染色质免疫共沉淀,发现c-di-GMP在体内和体外均对Arg R的DNA结合活性有明显的抑制作用。进一步对精氨酸合成通路进行液相色谱分析发现,高c-di-GMP水平菌株中产物精氨酸增加了14.6%,而底物L-谷氨酸减少了17.9%。因此,c-di-GMP明显促进细菌细胞内精氨酸的合成,同时减少了谷氨酸的积累。（4）转录因子Arg R受c-di-GMP诱导表达,Arg R能够与转录因子Cmr相互作用增强Cmr对nar K2-X的调控。C-di-GMP正调控arg C-H基因簇表达的同时也促进了arg R自身的表达量的增加。通过细菌双杂交和表面等离子共振实验发现,Arg R能够直接与另一个转录因子Cmr发生物理相互作用。进一步通过凝胶阻滞实验和表面等离子共振发现,Arg R与Cmr相互作用后促进了Cmr对nar K2-X启动子的结合,因而促进Cmr的正调控作用,这最终增强了细菌胞内的亚硝酸盐转运和细菌的无氧呼吸。（5）c-di-GMP通过减缓细菌的有氧呼吸调控分枝杆菌的缺氧适应能力。L-谷氨酸位于结核分枝杆菌代谢的关键位置,通过测量BCG菌株胞内的ATP和NAD+/NADH含量,发现高c-di-GMP水平菌株中的ATP含量和NAD+/NADH含量分别减少了51.8%和73.2%,表明c-di-GMP抑制了细菌的有氧呼吸。进一步用亚甲基蓝显示培养基中的含氧量显示,经过24 h的缺氧处理后对照菌株氧气已耗尽,而高c-di-GMP水平菌株中的氧气仍有剩余,表明c-di-GMP减缓了细菌细胞内氧气的消耗。综上所述,本论文在分枝杆菌中发现了第二信使分子c-di-GMP通过Arg R受体转录因子调控细菌适应缺氧压力的新通路:在缺氧压力诱导下,牛分枝杆菌胞内c-di-GMP含量显著增加,这一方面解除了Arg R对arg C-H基因簇的抑制,降低了细菌胞内谷氨酸的积累和TCA循环效率,因而导致细菌有氧呼吸减缓;另一方面,c-di-GMP不断诱导产生的Arg R蛋白通过与Cmr蛋白相互作用,促进Cmr对硝酸盐还原基因簇nar K2-X的正调控作用,从而有利于细菌开启无氧呼吸存活模式。这些工作拓展了我们对c-di-GMP多样化生理功能的理解,加深了对结核分枝杆菌缺氧适应调控机制的认识,同时也为阻断结核分枝杆菌感染过程提供了潜在药物新靶标。