目的：　　本研究旨在研究槐耳对放疗及内分泌治疗的影响，以期为临床上槐耳的合理应用提供依据。　　方法：　　槐耳是一种菌质提取物，具有多种生物学作用。为了明确其作用的具体机制，我们首先用8 mg/mL槐耳刺激MCF772h后提取RNA，然后对其进行了HTA2.0转录组基因表达谱检测，分析差异基因，并对差异基因进行GO分析以明确槐耳的具体生物学作用。　　根据槐耳刺激后的MCF7的芯片结果，我们进一步验证槐耳是否有放疗增敏作用。用克隆形成的方法检测有无槐耳刺激的乳腺癌细胞放疗后的增殖能力的差异，进一步确定槐耳对放疗有无增敏作用。根据放疗后细胞生物学改变的4“R”原则，我们用流式细胞仪检测槐耳对放疗细胞周期的影响，并进一步通过westernblot方法确定周期改变的具体机制。同时，利用细胞免疫荧光化学的方法，检测有无槐耳刺激的细胞的DNA断裂情况，并再次用Western blot的方法确定DNA修复通路是否有改变。　　根据槐耳刺激的MCF7芯片的结果，我们进一步验证槐耳是否有增敏内分泌治疗的作用。首先，利用PUBMED网络公共数据库，用GCBI网络分析软件，分别分析了他莫西芬耐药MCF7细胞、氟维司群耐药MCF7细胞、经氟维司群处理48h后MCF7细胞以及敲除ERα的MCF7细胞的基因表达谱的改变，对差异基因进行GO分析以了解DNA修复与内分泌耐药的相关性。　　根据对槐耳刺激的MCF7的芯片和网络公共芯片的分析结果，结合内分泌耐药细胞所呈现的DNA修复特点，我们进一步通过MTT验证有或无槐耳刺激的细胞对内分泌治疗药物（他莫西芬和氟维司群）的生长曲线的差异。之后，通过克隆形成的方法分析进一步验证槐耳对内分泌治疗的增敏作用。通过流式细胞仪检测槐耳单药、内分泌药物单药、内分泌药物+槐耳对细胞凋亡及周期的改变情况。利用Western blot实验验证槐耳对Rad51的调节作用。同时，我们建立了体内实验模型—构建了裸鼠皮下成瘤模型，分别对其喂食槐耳、他莫西芬、他莫西芬+槐耳，以观察最终成瘤大小。进一步用免疫组化的方法在体内验证不同药物刺激下组织内Rad51的表达情况。根据实验结果，构建过表达或敲除Rad51，再次用MTT的方法检测内分泌药物药效有无改变，反复验证Rad51对内分泌治疗疗效的作用。　　结果：　　1.槐耳对乳腺癌放疗有增敏作用　　用8 mg/mL槐耳刺激MCF7细胞72h后测基因表达谱芯片，对差异基因的GO分析结果显示，槐耳引起细胞多种功能的改变，其中改变较大的是细胞周期、细胞分裂及DNA损伤修复等生物学功能。芯片结果提示，槐耳有可能增敏放疗。接下来们用克隆形成实验来验证槐耳是否有放疗增敏作用。克隆形成结果提示，槐耳组放疗后细胞克隆形成能力明显减弱。槐耳组SF2值明显小于对照组SF2值。为了进一步比较两组曲线之间的差异，我们利用二次线性公式拟合曲线，计算相应的α、β值以描述曲线的特征。回归分析比较，p＜0.01，提示实验组和对照组的克隆形成曲线有显著差异。在另一细胞系MDA-MB-468细胞系中的验证结果与此一致。　　2.槐耳通过改变细胞周期时相、调控DNA修复通路两方面增敏放疗。　　用流式细胞仪分析槐耳刺激后细胞周期的改变。我们发现4 mg/mL槐耳刺激MCF7及MDA-MB-468细胞24h，两者G0/G1期细胞数目均较对照组明显显著增多，同时S期细胞明显减少。进一步用MCF-7细胞检测放疗后的细胞周期改变，我们发现给予6Gy的放疗剂量后24 h内，未用槐耳组出现了明显的G2/M期阻滞，而槐耳组无明显G2/M期阻滞出现。为明确槐耳引起阻滞的机制，我们进行了Western blot实验，结果提示Cyclin D1、CDK4下调是引起G0/G1期阻滞的主要原因。　　槐耳预刺激延长放疗后细胞DNA双链断裂(DSBs)的时间。γ-H2AX集簇是DSBs出现的标志。细胞免疫荧光的结果提示，给予1Gy的照射后，未经槐耳预刺激的乳腺癌细胞的γ-H2AX集簇所显示的荧光在0.5h达到最多，而后在4h显示出下降趋势，约8h后γ-H2AX集簇基本消失。而在接受过槐耳预刺激的细胞系，γ-H2AX集簇存在时间明显长于对照细胞，X线照射后12h仍然存在。提示槐耳预刺激能够延长DSBs时间。　　槐耳通过同源性修复(HR)途径调控DNA修复。Ku70、Ku86是非同源性末端连接(NHEJ)的标志蛋白，Rad51是同源性修复(HR)的标志蛋白。Westernblot结果显示，4 mg/mL槐耳能够明显下调Rad51，但对Ku70、Ku86无明显影响。进一步实验发现，乳腺癌细胞在接受6Gy的射线后，槐耳预刺激组Rad51呈时间依赖性的下调，而对照组Rad51在放疗后变化不明显，表明Rad51是槐耳增敏放疗的靶向分子。　　3.网络共享基因组芯片结果提示内分泌耐药及内分泌治疗与DNA修复密切相关，结合槐耳刺激MCF7的基因表达谱芯片结果，提示槐耳对内分泌治疗可能会有增敏作用。　　我们利用GCBI网络软件分析了PUBMED共享基因表达谱芯片，对差异基因进行了GO分析。结果提示他莫西芬耐药、氟维司群耐药、氟维司群处理48h、以及敲除ERα的MCF7细胞相对于对照组细胞来说均有DNA修复功能的显著改变，按照GO功能改变的显著性排序，DNA修复功能的改变均位于前50位，且在氟维司群处理48h的MCF7中，DNA修复功能的改变位于第三位。上述结果提示内分泌治疗与DNA修复功能相关。而我们对槐耳刺激MCF7细胞基因芯片的的分析结果提示，槐耳能够下调Rad51由此调控DNA的同源性修复通路，我们推测槐耳可以通过调节DNA修复功能增敏乳腺癌内分泌治疗。　　4.槐耳能够增敏乳腺癌的内分泌治疗。　　MTT结果显示槐耳与内分泌药物联合应用，细胞抑制率明显大于单用槐耳或单用内分泌药物。联合用药者CDI值(Coefficient of drug interaction)均＜1，部分CDI＜0.7。提示槐耳明显促进他莫西芬或氟维司群对乳腺癌细胞抑增殖作用。不仅如此，克隆形成实验显示，内分泌药物与槐耳联合应用形成克隆的数目明显减少，进一步证实槐耳的内分泌治疗增敏作用。接下来，我们用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期情况，结果提示，内分泌药物与槐耳联合应用组细胞凋亡数目显著增多，细胞G0/G1期阻滞更加严重，S期细胞比例明显降低。上述结果提示，槐耳可以增敏内分泌治疗。　　5.槐耳通过调控DNA修复通路增敏内分泌治疗。　　Western blot结果显示，内分泌药物他莫西芬、氟维司群及中药槐耳均可不同程度的下调Rad51，调控DNA同源性修复。与单用槐耳或内分泌药物相比，槐耳与内分泌药物联合后Rad51下调程度更加明显;同时，细胞周期蛋白CyclinD1，作为同源性修复途径中Rad51的重要辅助分子，也显著降低。γ-H2AX在内分泌治疗联合槐耳组显著升高，提示DNA断裂状态的持续存在。上述结果提示槐耳增敏内分泌药物疗效与Rad51下调为主的DNA同源性修复通路的抑制有关。裸鼠成瘤体内实验表明他莫西芬与槐耳联合组肿瘤明显较小，而单用内分泌治疗药物或单用槐耳组肿瘤大小介于两者之间，证实槐耳对他莫西芬的增敏作用;同时，肿瘤组织的免疫组化结果表明，他莫西芬联合槐耳组肿瘤组织内Rad51明显低表达。　　为了更充分的验证Rad51在槐耳增敏中的作用，我们在MCF7以及T47d细胞中过表达或敲除了Rad51，再次通过MTT实验观察内分泌治疗疗效的变化。结果表明，过表达Rad51后他莫西芬及氟维司群药效均降低，敲除Rad51后内分泌药物敏感性增加，证明Rad51确能调节内分泌治疗的敏感性。　　结论：　　(1)槐耳主要影响DNA同源性修复通路，且Rad51是其作用靶点，同时槐耳还可以下调Rad51的辅助作用因子CyclinD1，对放疗有增敏作用，这对放疗与槐耳的联合应用提供了坚实的理论依据。(2)乳腺癌的内分泌耐药及内分泌治疗与DNA修复功能的改变密切相关，DNA修复是增敏内分泌治疗的有效靶点。　　(3)槐耳同时减低了Rad51的水平及其与DNA损伤部位的结合能力，影响同源性修复，对乳腺癌内分泌治疗有增敏作用。　　意义：　　1.本研究确定了Rad51为槐耳的作用靶点之一，进一步明确了槐耳的作用机制。　　2.DNA修复功能的改变与内分泌耐药密切相关，此或可为科研、临床对内分泌耐药的研究提供一种思路。　　3.槐耳对乳腺癌放疗有增敏作用，此研究为临床上放疗患者同时应用槐耳提供了基础依据。　　4.槐耳对乳腺癌内分泌治疗具有增敏作用，此研究为临床上乳腺癌内分泌治疗同时应用槐耳提供了基础依据。