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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是引起幼畜腹泻的主要病原,其主要致病因子有菌毛和肠毒素,不同动物源ETEC菌株可能带有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)或F41等菌毛。因此,对菌毛的检测不仅可以对幼畜腹泻进行诊断,同时也为选择特异性治疗方法提供科学的实验依据。带有F5菌毛的ETEC是引起仔猪黄痢和仔猪白痢的主要病原,建立一种针对F5菌毛的特异、简便、准确的检测方法对仔猪大肠杆菌病的诊断和防治具有重要意义。胶体金免疫层析技术的发展和应用,为建立F5菌毛检测方法提供了新的思路和技术基础。采用辛酸-饱和硫酸铵法和亲和层析柱法联合纯化抗F5菌毛蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体。纯化后的单抗浓度为1.745mg/ml,经SDS-PAGE电泳分析IgG重链和轻链区带明显,腹水抗体效价由1.6×105上升为6.4×105。纯化后的多抗浓度为2.056mg/ml,经SDS-PAGE电泳分析IgG重链和轻链区带明显,血清抗体效价由3.2×104上升为6.4×104。纯化后的多抗和单抗可分别用于检测和标记。采用柠檬酸三钠法制备胶体金,通过检测证明金颗粒分布均匀,大小均一,适于标记抗体。用所制的金颗粒标记单克隆抗体,确定了抗体结合胶体金最佳结合量为54μg/ml,最适pH值为7.2。将金标抗体喷涂在结合垫上；在试纸条连接的硝酸纤维素膜上固定有抗F5菌毛蛋白的多克隆抗体作为检测线,羊抗鼠IgG的抗体作为质控线,组装试纸条。本研究对F5菌毛胶体金免疫层析试纸条的各项指标进行了优化,选择了效果较好的金标抗体稀释液(0.01M pH 7.2 PB(含0.5%BSA,1%海藻糖)、结合垫处理液(5%海藻糖含0.2%吐温-20)、封闭液(0.01M pH 7.2 Tris-cl含2% BSA,0.2%吐温-20)、样品垫处理液(0.02 MpH7.2 Tris-HCl含0.1%吐温-20)；硝酸纤维素膜(Sartorius CN 140)、结合垫(SB 06)、样品垫(SB 06)和吸收垫(S×27)；并确定了NC膜上检测线和质控线喷膜速度都为1.2μg/ml。经测试证明,本研究制备的F5菌毛胶体金免疫层析试纸条,最低检出量达到38.2μg/ml,试纸条与大肠杆菌的其它类型菌毛如：F4、F6、F41、F18ab无交叉反应,4℃条件下密封保存120天后仍能有效检出样品。用胶体金免疫层析试纸条对14份临床样品进行检测,结果与间接夹心ELISA、平板凝集实验、PCR方法所得结果符合率为100%。上述结果证明本研究制备的试纸条具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床样品的检验。