细胞穿膜肽（CPPs）是小于30个氨基酸的多肽,能将质粒DNA、寡核苷酸、小干扰RNA、多肽、蛋白质等多种“货物”传递到细胞内部。利用细胞穿膜肽进行载体运输具有高效、无毒、操作简便等优点。目前细胞穿膜肽已成功应用于各类细胞和小鼠体内的生物活性分子传递。然而,目前还没有将细胞穿膜肽应用于猪原代细胞的相关报道。转基因猪在基础研究、农畜牧业及人类疾病模型的研究中起了重要作用。对猪原代细胞进行基因组编辑是制备转基因猪的重要环节。现在的猪原代细胞基因组编辑技术有很多缺陷,如效率较低、细胞毒性大、操作繁琐等。转基因猪中携带的标记基因会影响目的基因和邻近的基因,也会带来转基因安全问题,同时,双等位基因敲除技术及条件诱导转基因技术在转基因猪中发展缓慢。这些技术缺陷大大限制了转基因猪的研究和应用。因此,发展新的转基因技术对于解决这些问题是非常重要的。为了研究细胞穿膜肽是否可以介导“货物”进入猪原代细胞并行使功能,本实验首先选择了三种之前研究比较清楚,穿膜效率高的细胞穿膜肽,包括TAT、R9和CPP5,分别与Cre重组酶融合构建成原核表达载体,进行原核表达和蛋白纯化。通过体外质粒重组实验和双色报告细胞实验证明蛋白具有活性。随后,通过Alexa 488荧光标记实验发现,三种细胞穿膜肽都可以高效地介导Cre重组酶进入猪原代细胞,并且随着蛋白浓度的提高,效率也随之提高,最高达到95%。为了确定三种细胞穿膜肽介导Cre重组酶进入猪原代细胞后,能否行使Cre重组酶的重组功能及重组效率,本实验利用“标准曲线法”分别检测了三种融合蛋白的重组效率。CPP5-Cre在高浓度下重组效率高达95%,但是TAT-Cre口R9-Cre相对较低。为了进一步提高重组效率,本实对三种细胞穿膜肽入膜机制进行研究,证明是能量依赖的内吞途径,而且通过内吞泡共定位实验发现,大部分蛋白都被包裹在内吞泡中,限制其进行重组作用。为此,我们利用促进内吞泡逃逸的HA2肽（流感病毒血凝素蛋白N端的20个氨基酸肽）和喹啉小分子进行TAT-Cre重组效率的优化,结果证明HA2和喹啉可将TAT-Cre重组效率提高到90%。为了考虑这些融合重组蛋白及小分子未来在猪原代细胞中的应用,本实验分别进行了细胞毒性研究,结果显示三种融合重组蛋白和HA2即使在高浓度下,对猪原代细胞也没有明显毒性,但是,喹啉在高浓度下具有明显的细胞毒性。随后,利用这个技术进行了猪标记基因删除的研究,结果证明利用TAT-Cre融合重组蛋白可以获得存活的标记基因删除的基因敲除猪。随后,为了优化大动物转基因技术,本实验又建立了一个多功能的自剪切技术。这个技术以条件诱导转基因为基础,可以简单、高效、快速的制备标记基因删除猪和双等位基因敲除猪。小鼠Oct4转录因子对小鼠的胚胎干细胞及诱导多能性干细胞的干性维持起重要作用,同时它还具有早期胚胎发育时期特异表达的特点,利用小鼠Oct4启动子特异启动Cre重组酶的条件诱导转基因为基础,与标记基因Neo连接在一起,同时两端带上loxP位点构建成一个OCN自剪切元件,将这个元件构建到MSTN基因敲除的打靶载体中,进行猪原代细胞基因打靶。小鼠Oct4在猪原代细胞中不表达,Cre重组酶不会切割两个loxP间的序列,可以进行标记基因的筛选。获得打靶阳性克隆后,进行核移植,克隆重构胚发育过程中小鼠Oct4启动子启动Cre表达,造成整个元件的自剪切,成功的在F0代获得标记基因删除的MSTN基因敲除猪。同时利用这个系统简单、快速的获得了标记基因删除的双等位基因敲除猪。综上所述,本实验首次将细胞穿膜肽扩展到转基因猪研究领域。利用此技术获得了标记基因删除的转基因猪。同时我们首次还构建了以胚胎期特异表达因子Oct4启动Cre重组酶为基础的自剪切系统,首次成功的将条件诱导转基因技术用于转基因猪。同时这套系统可以高效、简单、快速的制备标记删除的转基因猪和标记基因删除的双等位基因敲除猪。解决了大动物转基因技术存在生物安全等缺陷,这将极大的促进转基因猪在基础研究领域和人类疾病模型研究中的应用。