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目的:本研究旨在探讨年龄因素对心肌缺血再灌损伤的影响,研究NF-κB信号通路在老龄心肌缺血再灌注损伤易感性增加中的作用机制。应用携带IκBα（inhibitor of kappa B,IκBα）基因的重组AAV9载体,转染衰老心肌细胞或老龄小鼠心脏,在细胞及动物整体水平上探讨外源导入IκBα能否作为基因治疗药物,具有抑制NF-κB通路,降低炎症反应、氧化损伤和程序性细胞死亡（Programmed Cell Death,PCD）的作用,从而达到防治老龄心肌缺血再灌注损伤的目的。主要研究内容包括:1)建立小鼠在体缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤模型,对比研究年轻和老龄小鼠心肌易损性的差异,阐明NF-κB信号通路过度激活在老龄心肌缺血损伤易感性增加中的作用机制;2)细胞水平上,分离培养原代乳鼠心肌细胞,D-半乳糖诱导细胞衰老后,转染dsAAV9-CMV-IκBαS32A,S36A基因（dsAAV9-IκBα）和dsAAV9-CMV-e GFP（dsAAV9-e GFP）基因,建立缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,研究IκBα抑制NF-κB信号通路对衰老心肌细胞的保护作用及分子机制;3)动物整体水平上,靶向转导dsAAV9-IκBα基因至老龄小鼠心肌,建立I/R模型,探讨dsAAV9-IκBα基因过表达减轻老龄心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法:第一部分:选取3月龄和18月龄的雄性C57BL/6J小鼠,建立I/R模型,应用TTC+Evans蓝双染法检测心肌梗死面积,测定血清心肌酶（LDH、CK-MB）、炎性因子（TNFα,IL-6,IL-1β）和氧化损伤（MDA、SOD）指标;应用心脏超声Vevo（?）3100检测小鼠I/R后7天、14天、28天的心功能,Western blot检测NF-κB信号通路蛋白和程序性细胞死亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、GSDMD、Beclin-1）的表达。第二部分:分离培养大鼠乳鼠心肌细胞（Neonatal rat ventricular cardiomyocytes,NRVMs）,首先给予10g/L D-半乳糖刺激心肌细胞48h建立衰老心肌细胞模型,转染dsAAV9-e GFP及dsAAV9-IκBα病毒5天,建立H/R模型,应用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡和细胞焦亡比例,Hochest/PI染色检测细胞焦亡比例,JC-1检测线粒体膜电位（Δψm）的变化、ELISA检测上清炎症因子的水平,测定细胞MDA和SOD的含量评估氧化损伤。免疫荧光及Western blot检测NF-κB信号核转位,同时测定炎性小体（NLRP3）、细胞焦亡（Caspase-1、GSDMD、IL-1β）、自噬（Beclin-1、LC3Ⅰ/Ⅱ）和凋亡（Bax、Bcl-2）相关蛋白的表达。第三部分:选取18月龄的C57BL/6J雄性小鼠,分别尾静脉注射dsAAV9-e GFP、dsAAV9-IκBα病毒5周后,建立老龄小鼠I/R模型,测定小鼠心肌梗死面积、心功能、心肌酶、炎性因子和氧化损伤指标,应用TUNNEL法测定心肌细胞凋亡指数,CD45和CD68标记的抗体检测白细胞和巨噬细胞浸润情况,Western blot检测NF-κB信号通路蛋白、炎性小体（NLRP3）、细胞焦亡（Caspase-1、GSDMD）、细胞凋亡（Bax、Bcl-2）及自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3Ⅰ/Ⅱ）的表达。结果:第一部分:1)与年轻组相比,老龄组的梗死面积显著增加（57.89±2.55%vs45.92±2.63%,P<0.05）;且I/R后28天的左室射血分数（Ejection fraction,EF%）明显下降（21.28±3.11 vs 31.60±3.71,P<0.05）,心肌酶、氧化损伤和炎症水平则更高（P<0.05）;2)随着缺氧和再灌注的时间延长,胞浆蛋白IκBα、p65、p50水平降低,而核蛋白p65、p50则显著升高,提示NF-κB信号通路在缺血及再灌注阶段均激活。和年轻组相比,老龄组心脏出现更显著NF-κB信号激活（P<0.05）。（3）与年轻组相比,老龄I/R心肌组织Bax/Bcl-2比值、Beclin-1及GSDMD-N表达显著增加,提示老龄组小鼠I/R后出现更为严重的程序性细胞死亡（P<0.05）。第二部分:1)转染dsAAV9病毒至心肌细胞5天时,GFP荧光强度达70%,且GFP及IκBα蛋白表达显著增加（P<0.05）,提示转染成功;2)和正常对照相比,给予H/R后,衰老心肌细胞的细胞活力、SOD活性、Δψm水平显著下降,细胞MDA含量、LDH和IL-1β水平明显增加,而IκBα转染可有效逆转上述结果,提示IκBα转染可对抗H/R导致的线粒体功能紊乱、氧化损伤和心肌细胞毒性作用（P<0.01）;3)流式细胞仪测定细胞凋亡比例,结果显示正常对照组Annexin V-PE+/7-AAD-细胞比例为4.78±0.78%,H/R对照组和GFP组分别为37.33±1.32%和39.83±0.45%,而IκBα组下降为21.370±4.04%（P<0.05）,表明IκBα可对抗H/R诱导的心肌细胞凋亡。同时,正常对照组Annexin V-PE+/7-AAD+细胞比例为9.63±0.39%,H/R对照组和GFP组分别为至18.57±2.99%和18.13±1.92%,而IκBα组下降至7.56±2.40%（P<0.05）,提示IκBα可对抗H/R诱导的心肌细胞焦亡;4)Hoechst/PI染色进一步评价细胞焦亡情况发现,正常组PI染色阳性细胞的比例为1.83±0.38%,HR对照组和GFP组的则分别为42.37±3.06%和41.53±2.09%,而IκBα组降低至17.90±2.01%（P<0.05）,提示IκBα可对抗H/R诱导的心肌细胞焦亡;5)免疫荧光及Western blot结果显示IκBα转染有效抑制H/R诱导的p65发生核转位;6)H/R可促使衰老心肌细胞程序性细胞死亡相关蛋白表达增加,而IκBα转染通过降低Bax/Bcl-2比值减轻细胞凋亡,下调Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ比值减轻自噬效应,抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD轴对抗细胞焦亡。第三部分:1)Western blot结果显示IκBα基因可有效转导至老龄心肌并抑制I/R后NF-κB信号通路的激活;2)和GFP组相比,IκBα基因过表达可降低老龄小鼠I/R后心梗面积（56.92±3.22%vs 26.33±1.54%,P<0.01）和心肌细胞凋亡指数（26.67±1.65%vs 11.83±0.95%,P<0.01）,表明IκBα过表达可有效保护老龄缺血心肌;3)炎性细胞局部侵润检测结果显示,IκBα转染明显减轻老龄心肌I/R后的白细胞和巨噬细胞侵润程度,与I/R组相比差异有统计学意义（P?0.05）,并降低炎症因子水平（TNFα,IL-6,IL-1β）,提升SOD活性,降低MDA含量和心肌酶水平（CK-MB、LDH）,差异有统计学意义（P<0.05）,提示IκBα过表达具有抗击炎症反应和氧化损伤的作用;4)Western blot结果显示IκBα过表达可抑制I/R诱导的细胞自噬、凋亡及焦亡相关蛋白的表达,提示IκBα通过抑制程序性细胞死亡来减少I/R导致的心肌损失;5)超声结果显示,IκBα组显著降低I/R术后7天和14天时的左心室收缩末期面积（Left ventricular end-systolic area,LVESA）、左心室舒张末期面积（Left ventricular end-diastolic area,LVEDA）和左心室收缩末期容积（Left ventricular end-systolic volume,LVESV）,提升EF值和面积变化分数（Fractional area change,FAC）,差异有统计学意义（P<0.05）,但这种保护作用在I/R术后28天减弱,差异无统计学意义（P>0.05）,提示IκBα转染可有效减轻老龄小鼠心脏扩大并改善心功能。结论:（1）老龄小鼠I/R后内源性心肌损伤加重,自噬效应、细胞凋亡、细胞焦亡增加,而NF-κB信号通路过度就可能是介导老龄心肌缺血再灌注损伤的年龄异质性的关键靶点。（2）细胞水平上,外源性转染IκBα基因通过抑制NF-κB信号通路,减轻氧化损伤和炎症反应,降低自噬水平,减少因心肌细胞凋亡和细胞焦亡,稳定线粒体功能,最终提高心肌细胞活力,达到保护衰老心肌细胞的作用。（3）动物水平上,靶向转染IκBα作为一种小分子基因治疗药物,可以有效抑制NF-κB信号通路的激活,改善炎症和氧化损伤,减少程序性细胞死亡（细胞凋亡,粒化,自噬）,减轻心肌梗死面积并改善老年小鼠的心脏功能,证明靶向抑制心肌NF-κB信号通路激发心肌内源性抗损伤能力是防治老龄心肌缺血再灌注损伤的关键环节,为老年心肌缺血/再灌注损伤的防治提供新的策略。