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研究背景炎性痛作为常见的临床病症之一,严重影响了患者的工作和日常生活。尽管近年来关于炎性痛发病机制及其治疗方法的研究取得了较大的进展,但是最佳的治疗手段对于临床医生来说仍是一项巨大的挑战。背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)中神经元作为痛觉传导的初级神经元,在外周敏化和中枢敏化传递过程中发挥着关键的桥梁作用。而这些神经元的异常持续放电与DRG中痛相关受体、电压依赖性离子通道、酶等分子在基因转录和翻译水平的表达改变有关。髓样锌指蛋白1(Myeloid zinc finger 1,MZF1)属于C2H2锌指转录因子的Kruppel家族成员,其作为一种双功能转录因子,在转录和翻译的过程中发挥关键作用。本课题组前期研究发现,DRG中MZF1通过调控电压门控钾离子通道(Voltage-gated potassium channel,Kv)的表达,增强DRG神经元的兴奋性和异位放电频率介导大鼠神经病理性疼痛的发生和维持。但是,DRG中MZF1能否参与炎性痛的发生和维持,目前尚无报道。本研究拟评价MZF1在大鼠炎性痛中的作用及其分子机制,有望为炎性痛的治疗提供新的思路和理论依据。研究目的本研究选用足底皮下注射完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)诱导的大鼠慢性炎性痛模型,首先观察L4/5 DRG中MZF1的表达变化,然后通过DRG显微注射MZF1siRNA抑制MZF1表达探究MZF1在慢性炎性痛发生与维持中的作用,并进一步探讨MZF1介导慢性炎性痛的分子机制。实验方法1足底注射CFA大鼠DRG中MZF1的表达变化及细胞分布类型雄性SD大鼠20只,采用随机数字表法分为2组(n=10):实验组(CFA组)和对照组(NS组),足底注射CFA或生理盐水前3 d时开始测量大鼠后足机械性撤足阈值(Paw withdrawal threshold,PWT)和热缩足潜伏期(Paw withdrawal latency,PWL)至 CFA 注射后 14 d,利用 qRT-PCR 和 Western Blot技术检测L4/5 DRG中MZF1的转录水平以及蛋白表达水平的变化情况。利用免疫荧光技术检测L4/5 DRG中MZF1的表达变化及细胞分布类型。2 DRG中MZF1在CFA诱导的大鼠慢性炎性痛发生与维持中的作用雄性SD大鼠30只,采用随机数字表法分为5组(n=6):Naive组、Naive+MZF1 siRNA 组、CFA+MZF1 siRNA 组、CFA+Vehicle 组和 CFA+Scramble siRNA组。建模前1 d时各组大鼠行L5 DRG显微注射MZF1 siRNA、生理盐水或 Scramble siRNA。于建模后 1、2、3、7、14、21d 时测量 PWT 和 PWL 值,证明DRG中MZF1在慢性炎性痛发生中的作用。雄性SD大鼠24只,采用随机数字表法分为4组(n=6):Naive+MZF1 siRNA 组、CFA+MZF1 siRNA 组、CFA+Vehicle 组和 CFA+Scramble siRNA组。建模后3 d时各组大鼠行L5 DRG显微注射MZF1 siRNA、生理盐水或Scramble siRNA。于建模后 1、3、4、6、8、10、14 d 测量术侧的 PWT 和 PWL值,验证DRG中MZF1在慢性炎性痛维持中的作用。3 DRG中MZF1介导大鼠慢性炎性痛的分子机制采用qRT-PCR、Western Blot技术检测炎性痛模型大鼠DRG中MMP-2和MMP-9在转录水平和蛋白水平的表达变化。28只雄性SD大鼠随机分为4组(n=7):Saline+Vehicle 组、CFA+Vehicle 组、CFA+MZF1 siRNA 组、CFA+Scramble siRNA组。足底注射CFA或生理盐水后3 d时各组大鼠L5 DRG显微注射 MZF1 siRNA、生理盐水或 Scramble siRNA,3 d 后取材行 qRT-PCR(n=3)、Western Blot(n=4)检测MZF1、MMP-2和MMP-9转录和蛋白水平的变化。ChIP-PCR技术检测MZF1与MMP-2/9启动子区的结合情况,免疫荧光技术检测MZF1与MMP-2/9的共定位情况。实验结果1 CFA引起大鼠痛觉过敏及L4/5 DRG中的MZF1的表达上调痛行为学数据显示,与NS组相比,CFA组大鼠PWT值于造模后6h时开始下降,并持续至造模后14 d;而PWL值于造模后6 h时开始下降,并持续至造模后10 d,上述结果提示足底注射CFA诱发大鼠产生异常痛和痛觉过敏。qRT-PCR结果显示,与0 d时相比,大鼠于造模后6 h时同侧L4/5 DRG中MZF1 mRNA表达上调,并可持续至7 d,其中于6 h时表达水平最高。Western Blot结果显示,与0d时相比,大鼠于造模后6h时同侧L4/5 DRG中MZF1表达上调,并持续至7 d,其中于1d时表达水平最高。上述结果提示,足底注射CFA可诱发大鼠同侧L4/5 DRG中MZF1在转录和蛋白水平表达上调。免疫荧光单染结果显示,与0 d时相比,大鼠于造模后1 d时同侧L4/5 DRG中MZF1阳性细胞数增加,并持续至7d。免疫荧光双染结果显示,MZF1可与NF200(A类神经元marker)、IB4(C类非肽能神经元marker)、GFAP(卫星胶质细胞marker)共标,结果提示,DRG中MZF1在A型、C型神经元和卫星胶质细胞中均有表达。2 MZF1在CFA诱导的慢性痛中的作用痛行为学数据显示,于建模前1 d时L5 DRG显微注射MZF1siRNA,与DRG显微注射溶剂相比,MZF1 siRNA可以减轻CFA诱发的PWT和PWL的下降。于建模3 d时L5 DRG显微注射MZF1 siRNA,能缓解CFA诱发的PWT和PWL的下降。即在疼痛的发生和维持阶段,MZF1 siRNA能缓解CFA诱发的异常疼痛和痛觉过敏。并且L5 DRG显微注射MZF1siRNA不会对大鼠的基础痛阈发生影响。3 MZF1通过调节MMP-2/9的表达参与慢性炎性痛Western Blot、qRT-PCR 结果显示,CFA 注射后同侧 L4/5 DRG 中 MMP-2/9的蛋白及mRNA表达水平明显上调,与Od对比,大鼠于造模后6h时同侧L4/5 DRG中MMP-2和MMP-9的表达上调,并维持至7 d,其中于1 d时表达水平最高,并持续至7 d。与L5 DRG注射溶剂组相比,DRG注射MZF1 siRNA可以逆转MZF1、MMP-2/9 mRNA和蛋白表达上调。免疫荧光双染显示,MZF1与MMP-2/9在DRG神经元中共定位。ChIP-PCR结果显示,MZF1可以与Mmp2和Mmp9的启动子区域结合,说明转录因子MZF1可以直接调控MMP-2/9的表达参与慢性炎性痛。实验结论在足底注射CFA建立的慢性炎性痛模型中,CFA可以引起大鼠L4/5 DRG中MZF1、MMP-2和MMP-9的表达上调,转录因子MZF1通过直接与Mmp2和Mmp9的启动子区域结合调控慢性炎性疼痛的发生和维持。