背景与目的p地中海贫血(β-thalassemia,简称p地贫)是一种常见的严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病,主要分布在全球的热带和亚热带地区,在我国广东和广西是发生率最高的两个省区,其基因携带率分别高达2.54%和6.43%。β地贫为常染色体单基因隐性遗传病,是由染色体11p15.3的β-globin基因突变导致p珠蛋白肽链合成减少或缺失而导致的一种疾病,β地贫携带者(轻型β地贫；β-thalassemia trait, TT)婚配的下一代有1/4的机会罹患有严重溶血性贫血症状的中、重型p地中海贫血(P-thalassemia intermedia, TI; β-thalassemia major,TM)。值得注意的是同是纯合子或双重杂合子的β地贫患者,其临床表型从中间型(Hb 60-100 g/L)到重型(Hb<60 g/L,严重者20-40 g/L)存在很大差异,研究表明β地贫的表型变化首先是由其致病基因的突变来决定的,即临床表现与β珠蛋白基因的突变基因型直接相关,β基因完全被抑制的β0突变纯合子(β0/β0)一般都表现为重型β地贫,而β基因部分被抑制的旷突变纯合子(β+/β+)则多表现为中间型β地贫,而双重杂合子(β0/β+)可能表现为中间型β地贫,也可能是重型β地贫。目前无论是在人类还是在小鼠模型的研究中均已有报道一些β-globin基因以外的基因对β地贫临床表型的严重性起着修饰作用,例如分子伴侣AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein), HRI基因(Heme-regulated eIF2alpha kinase)等等。但下列两种能减轻α/β链比例失衡程度的遗传修饰因素是最主要因素：(1)患者同时合并α地贫突变而减轻(反之,合并α-globin基因三联体或多拷贝而加重)；(2)患者同时合并引起胎儿血红蛋白(Fetal hemoglobin, Hb F; α2γ2)升高的遗传变异缓解疾病的严重性。我们课题组之前的研究证实AHSP基因变异不是中国人p地贫临床表型的主要遗传因素,此外,我们还系统研究了中国人中间型p地贫的分子缺陷原因,结果提示还存在其他一些未知的遗传修饰因素对β地贫的表型变化有贡献。EKLF/KLF1是Kruppel样转录因子家族(Kruppel-like transcription factors, KLFs)成员之一,其羧基端含三个串联的锌指结构域,通过特异性的识别结合保守的DNA序列5’-CCMCRCCCN-3’启动下游基因的转录从而调节红细胞一系列的生长发育过程。近几年研究证明,KLF1作为一个重要的调控因子参与调控了胎儿血红蛋白(Hb F)向成人血红蛋白(Adult hemoglobin A, Hb A; α2γ2)的转化过程；2010年的一项研究发现KLF1的显性突变(p.E325K)可以导致先天性红细胞生成异常性贫血四型(Congenital dyserythropoietic anemia, CDAⅣ)；2014年报道了KLF1双重突变可以导致先天性的慢性非球形红细胞溶血性贫血(Chronic nonspherocytic hemolytic anemia, CNSHA);但是有更多的研究显示KLFl单等位基因的突变仅仅导致一系列的良性表型,如In(Lu)稀有血型,Hb F和成人血红蛋白A2 (Adult hemoglobin A2,Hb A2; α2δ2)升高(这两点均为p地贫的重要特征,且Hb F升高有利于改善p地贫患者临床表型严重性)等。然而,目前没有任何研究展开基于人群遗传学的KLFl突变研究,亦没有关于KLF1突变与β-globin突变共遗传的表型研究。因此,本次研究首次通过分子筛查一个大样本中国人群来调查KLFl基因的突变率与突变谱,并通过表型研究来评估KLF1突变是否对p地贫具有遗传修饰作用。设计与方法一、研究人群、病人和表型检测本研究通过随机抽样对长期居住在中国南方地区的3918例非亲缘关系个体进行了突变分析,这个大人群队列包括：3839例连续采集的样本和79例表型导向型样本(Hb A2水平：3.3%-4.1%和/或Hb F水平大于1.5%)。KLF1人群突变频率通过调查3839例连续采集的样本得出,而KLF1突变谱由所有3918例筛查到的所有突变组成,所有KLF1突变的阳性样本均用来进行表型分析。3839例连续采集的样本(年龄1-50岁；1987例男性,1852例女性)由三个队列组成：队列A,1971例非地贫人群；队列B,946例β地贫携带者；队列C,922例p地贫中重型病人(根据回顾性的临床指标分为568例重型,354例中间型)。队列A从本课题组前期对广西地区进行地贫流行病学调查的样本中随机抽出,队列B和C样本收集于2008年11月份至2013年6月份。79例表型导向型样本(队列D)用Hb A2和Hb F这两个指标进行筛选,为的是富集KLFl突变个体。所有南方人群均来自中国地贫高发区域：广东省或者广西壮族自治区。与此同时,我们通过采集携带KLF1突变的p地贫患者进行了家系研究,以确认突变是自发突变还是遗传性突变。另外,我们还召集了中国非地贫高发区域的1190例个体作为对照研究,他们来自中国北方地区山东省。所有的血液学参数均用自动血细胞计数仪测定,血红蛋白组分分析运用高效液相色谱法进行测定。红细胞表面抗原CD44表达量运用流式细胞仪分析。二、分子遗传检测DNA提取采用传统的酚/氯仿抽提法。通过高分辨率熔解曲线技术分析(HRM assay)筛查所有参加者的KLFl变异,运用第一代测序对所筛查的变异进行验证。一共设计9对引物覆盖KLFl基因的编码区(外显子1-3)和非编码区(启动子区、剪接位点、5’UTR和3’UTR)。与此同时,我们对最主要的4个与Hb F升高相关的SNP位点进行了基因分型,其中3个位点运用HRM技术进行SNP分型(BCL11A:rs11886868 和 rs766432; HBS1L-MYB:rs9399137),1个SNP位点应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)进行分型(HBG2:rs7482144, XmnI)。根据科室早前地中海贫血流行病学调查研究中所用的分子筛查方法来验证HBA和HBB基因上的缺失型和点突变。对于KLF1变异是否是功能性突变主要基于两点标准：(1)根据表型的变化：携带者Hb F水平大于1%同时/或红细胞表面抗原CD44表达下降；(2)生物信息学预测：应用SIFT (http://sift.jcvi.org)和PolyPhen-2 (http://genetics. bwh.harvard.edu/pph2)软件来预测所发现的KLF1变异是否影响其蛋白质结构和功能。三、统计分析所有的统计分析均使用SPSS 19.0统计软件或R语言进行,P<0.05视为具有显著的统计学差异。所有数量变量均用曼惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)或卡方检验(X2 test)评价是否存在显著性差异。多因素分析应用Cox比例风险回归模型(Cox proportional hazards model)评估8个潜在修饰因素(协变量),包括性别因素,HBA基因型,HBB基因型,KLF1基因型,XmnI, rs 11886868,rs766432和rs9399137与922例地贫患者表型轻重的关系(以患者首次输血时间为因变量),计算各个潜在修饰因素的比值比(Hazard ratios, HR),并以95%的置信区间(Confidence intervals, CI)呈现。当协变量的P大于0.1将会被排除出Cox回归的模型,模型预测的准确性以Harrell’s一致性系数(Harrell’s concordance index)评价,模型拟合度用R2来评价(R version 3.0.1 rms语言包)。单因素分析应用Mann-Whitney U test或X2 test来比较携带KLF1突变组和未携带KLF1突变组p地贫的临床表型差异,根据Kaplan-Meier绘制无输血生存曲线,并用对数秩检验(log-rank test)比较两组曲线间的统计学差异。应用拟合优度χ2检验(Goodness-of-it Chi-square test)分析各SNP位点基因型分布在本研究的患者人群中的分布是否符合哈迪-温伯格平衡定率(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。结果一、中国南方地区人群具有相对高的KLF1突变率中国南方人群KLFl突变率在队列A,队列B,队列C的突变率分别是：1.27%(25/1971),1.16%(11/946),1.30%(12/922),且这三组之间没有统计学差异,P=0.959,但南方人群KLF1总突变率显著高于北方人群(1.25%vs.0.08%,P<0.001),说明KLFl突变在中国南方人群有相对高的突变频率,且在地中海贫血流行区域更为常见。二、广泛的KLFl突变谱3839例连续采集的南方人群样本(队列A,B,C)中共鉴定出48个突变的KLF1等位基因,79例表型导向型样本共发现16个,检出率为20.25%。这64个突变的KLFl等位基因共有7种不同的KLF1突变,组成了中国南方人群的KLF1突变谱。41例个体仅仅有KLFl杂合突变(来自队列A的25例与来自队列D的16例)；11例为KLF1杂合突变合并β杂合突变(来自队列B)；12例为KLF1杂合突变合并β双重杂合突变(来自队列C)。这些突变中有4种KLF1突变在之前的研究中已经报道(p.Gly176AlafsX179, p.Ala298Pro, p.Thr334Arg和c.913+1G>A),另外3种突变为世界首报的新突变(p.His299Asp, p.Cys341Tyr和p.Glu5Lys);从突变类型来看,有5种错义突变(p.Glu5Lysp, Ala298Pro, p.His299Asp, p.Thr334Arg和p.Cys341Tyr),1种移码突变(p.Gly176AlafsX179)和1种剪切突变(c.913+1G>A)；从突变位于基因的功能区域来看,有6种突变会破坏KLF1的锌指结构域(p.Gly176AlafsX179, Ala298Pro, p.His299Asp, p.Thr334Arg, p.Cys341Tyr和c.913+1G>A);从突变谱看,p.Gly176AlafsX179和p.His299Asp为最主要的两种突变,占所有突变的90.6%。另外本研究还报道了13种新的中性KLFl变异,包括4种错义突变、4种同义突变和5种3’UTR突变。所发现的这些突变首次展现了KLF1基因人群广泛的突变谱。三、KLFl突变可改变正常个体血液学参数通过对41例携带KLFl突变的非地贫人群(25例来自队列A,16例来自队列D)进行血液学分析,发现无论是平均红细胞体积(Mean corpuscular volume,MCV)还是平均红细胞血红蛋白量(Mean corpuscular hemoglobin,MCH)与1946例未携带KLF1突变的非地贫人群相比都轻微的降低了(MCV:82.45±5.39 vs. 89.29±4.77 fL,P<0.001；MCH:26.95±2.11 vs.29.46±1.44 pg,P<0.001)。另外,这41例个体的Hb A2和Hb F水平也有一定程度的升高,分别为3.28±0.45%和3.44±1.75%。因此,本研究首次通过人群研究发现轻微升高或者处于临界值的MCV和MCH是KLF1基因突变的重要表型,与升高的Hb A2和Hb F这两个已发现的指标一样,可以提高筛查KLF1基因突变的阳性率。四、KLF1突变可改变β地贫携带者的血液学表型本研究对14例KLF1杂合突变与β0杂合突变共遗传的个体进行了血液学分析,其中7例β0/βN来自队列B(队列B中1例β+/βN,1例βE/βN,2例β0/βN合并α地贫被排除分析),另外7例β0/βN来自家系样本。意外的是,这14例个体MCV或MCH与217例β0杂合突变携带者相比,并未显得更低,无统计学差异(MCV:63.53±3.94 vs.65.11±4.34 fL,P=0.112；MCH:20.26±1.42 vs. 20.34±1.37pg,P=0.567).另外一方面,这14例个体显示出了相当高的Hb A2((α282)水平(6.47±0.81%,最低5.10%,最高8.00%),显示出KLF1突变和β-globin基因突变对δ-globin基因表达升高的叠加作用；与此同时,我们注意到这些样本具有升高的且变异的Hb F水平(7.67±4.11%,最低3.60%,最高18.20%),但其变异性有待进一步研究。五、KLF1突变可减轻β地贫患者临床表型严重性为了评价KLF1突变对β地贫患者临床表型的修饰作用,我们全面研究了922例β地贫患者的临床表型和目前已知的潜在的减轻p地贫患者临床表型的遗传因素。我们意外的发现2种KLFl突变选择性的出现在12例中间型β地贫患者(TI)中(其中10例携带p.Gly176AlafsXl 79,2例携带p.His299Asp).通过Cox比例风险回归模型(Cox proportional hazards model)对8个潜在修饰因素进行评估结果显示,KLF1基因突变对p地贫患者临床表型修饰作用最大(HR=0.213,P<0.001),其次是HBB基因型(β+,HR:0.353,P<0.001),XmnI(+, HR=0.512,P<0.001),HBA突变(HR=0.671,P<0.001),rs9399137(HR= 0.724,P<0.001)rs766432(HR=0.761,P<0.001),但性别因素(HR=0.893.P=0.107)和rs11886868(HR:0.871,P=0.415)这2个因素被模型排除。12例TI的基因型中7例是β0/β0+αα/αα,3例β0/β++αα/αα,2例β0/β0+—SEA/αα,我们通过单因素分析[β0/β0+αα/αα,XmnI(-/-),rs766432 )(AAor AC),rs9399137 (TT or CT)]比较7例携带KLFl突变和362例无KLFl突变的β地贫患者临床表型,结果显示这7例β地贫患者表现出相对轻的临床表型：较高的Hb水平(82.57±7.81 vs.66.33±17.53g/L,P=0.006),较高的Hb F水平(39.58±21.80 vs.9.17±11.05 g/L,P<0.001),相对少的输血次数(OR:0.082,P=0.007)和较低的TM风险率(OR=0.009,P<0.001).Kaplan-Meier无输血生存曲线显示出显著的差异存在这两组中(P<0.001),其第一次输血的中位时间分别是36个月和6个月。另外,所有携带12例KLFl突变的TI第一次输血的中位时间是48个月,而922例β地贫患者人群中的342例非携带KLF1突变的TI第一次输血的中位时间是24个月,但统计学并未显示出两者间具有差异(P=0.093),显示出两组TI具有一定的同质性。结论一、本研究首次设计人群遗传学大样本的研究调查出KLF1基因突变在中国南方和中国北方地区的人群突变率,证明KLF1基因突变在地中海贫血流行区域更常见(1.25% vs.0.08%)。与此同时,鉴定出的64个KLF1突变全面的展现出中国人群广泛的KLF1突变谱。二、首次通过对携带KLF1突变的非地贫样本和β杂合子样本的基因型与表型样的分析,系统阐明了KLF1突变可以引起MCV和MCH轻微降低或处于临界值,Hb A2水平和Hb F水平升高；功能性突变可以使红细胞表面抗原CD44表达降低。这些变异的表型有助于KLF1突变的人群筛查。三、应用Cox比例风险回归模型全面系统的评估了包括KLF1突变在内的8个因素对922例β地贫患者的临床表型修饰作用,发现KLF1突变可以减轻β地贫患者的临床表型且影响作用最强,对精确诊断β地贫、产前诊断、遗传咨询和基因诊断方面提供了重要依据和线索。