论文部分内容阅读
中国卤虫(Artemia sinica)是一种广泛生活在高盐水体的小型甲壳动物,具有极强抗逆能力,在遇到不利环境时,能进入滞育阶段,形成特殊的滞育卵而暂时停滞发育,当环境适宜时能解除滞育重新发育,因其具有该项特点,已经成为发育生物学研究的实验生物。 泛素化途径通过E1,E2,E3一系列酶的催化降解靶蛋白,APC/C是一个代表性的E3泛素连接酶,并通过26S蛋白酶体降解特定的有丝分裂调节因子。CDC20(cell division cycle20)是后期促进复合物APC/C的两个辅酶因子之一,能在特定时间点结合并激活APC复合物而发挥作用,在指导细胞周期相关蛋白泛素化降解的过程中发挥重要的作用,保证正常的染色体分离。由于大部分的细胞周期相关蛋白都通过泛素化途径进行降解,CDC20在对细胞周期的调控作用起关键作用。然而,目前为止对As-CDC20在中国卤虫滞育卵重新发育的过程中对细胞周期的调控作用尚不清楚。 在本研究中,首次成功克隆得到了As-cdc20长度为1842bp的基因全长,包括1512bp的开放阅读框,50bp的5UTR以及280 bp的3-UTR,编码氨基酸503个,蛋白分子量为55.5KDa。生物信息学分析显示As-CDC20主要定位于细胞核,为一个非跨膜非分泌性的亲水性蛋白质,包含30个预测的磷酸位点。蛋白多序列分析显示CDC20为高度保守蛋白,尤其在WD40结构域区域。原位杂交结果显示As-cdc20在中国卤虫各发育时期的表达部位不存在组织或器官特异性。实时荧光定量PCR及免疫印迹试验分别从基因及蛋白水平对As-CDC20的表达量进行分析,结果显示在卤虫发育至5h时,表达量达到峰值,并随着卤虫的发育而逐渐降低;与此同时,对As-CDC20在应对高盐、低温的环境刺激下的表达水平进行分析,结果表明在不良条件下的表达量均低于正常条件。 该研究分析了CDC20在中国卤虫早期胚胎发育过程的表达模式,从而阐述了CDC20在卤虫发育阶段对细胞周期的调控及在卤虫滞育卵重新发育过程中的关键作用,为进一步研究滞育的形成及解除以及CDC20在脊椎动物中的深入研究提供了理论基础。