研究背景：脑作为人体神经系统的高级中枢,在控制人体的感觉、情绪、记忆、运动以及逻辑推理等功能上起到了“中央处理器”的作用。然而随着社会的发展,人类正遭受越来越多的与脑有关的疾病的折磨,例如癫痫、帕金森、阿尔茨海默尔病、精神分裂和抑郁症等,严重威胁着人类的身体健康乃至生命。因此,研究脑中与这些疾病的发生发展相关的作用机理,并寻找有效的靶基因或治疗方法就变得十分有意义。神经营养因子家族是脑内广泛存在的一种蛋白,对于促进细胞分化、神经生长和神经元的存活,维持正常的脑功能十分重要。而且神经营养因子的代谢异常通常也与上述某些疾病的发生发展密切相关。其中,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是目前研究最多的神经营养因子之一。BDNF是中枢神经系统中分布最为广泛的一种神经营养因子,在个体发育期和成年期都有广泛的表达。BDNF是一种分泌蛋白,主要是通过与两种不同的受体：高亲和力的酪氨酸激酶受体B (Tropomyosin-related kinase B,TrkB)受体和低亲和力的p75受体结合调节神经元的结构和功能。BDNF与TrkB的结合,可以激活胞内MAPK/ERK, PLCy和PI3K三条信号通路,从而对轴突生长、神经元存活和分化、突触可塑性以及学习和记忆起到积极的调节作用。而BDNF与低亲和力的p75受体的结合,通常对神经元起到负向调节的作用,比如诱导凋亡,引起抑郁症的神经可塑性等。研究表明,BDNF与脑的高级功能学习记忆密切相关,参与多种学习记忆的过程,如Morris水迷宫、环境依赖的恐惧记忆等。此外,BDNF还与许多神经系统疾病的发生发展息息相关,某些特定神经元BDNF表达的改变将导致不同的疾病,包括抑郁症、癫痫、阿尔茨海默尔病、精神分裂、亨廷顿以及帕金森病等。这些说明BDNF在维持中枢神经系统正常的生理功能中起着十分重要的作用。近年来的研究发现,人群中广泛分布着一种BDNF Va166Met基因单核苷酸多态性(BDNFMet),使得BDNF前体蛋白第66位的缬氨酸变成了甲硫氨酸,导致活性依赖性的BDNF分泌水平降低。拥有这种基因多态性的个体相对于正常个体拥有明显的神经系统结构的改变,例如海马(hippocampus, HPC)容积的萎缩和突触可塑性的降低等,而且更容易表现出焦虑、抑郁和恐惧记忆障碍等诸多功能上的缺陷。然而,关于BDNFMet基因多态性与其他功能(如空间记忆、工作记忆等)之间的关系以及BDNFMet引起这些结构和功能变化的具体分子机制仍不十分清楚。BDNF Va166Met转基因小鼠的构建为我们提供了良好的实验模型。本课题以BDNFMet转基因小鼠为模型,通过与野生型(wild type, WT)小鼠相比较,研究基础状态下,BDNFMet变异对小鼠个体行为的影响。然后,通过高通量的基因表达谱芯片技术,筛选出在BDNFMet变异小鼠的背侧海马、腹内侧前额叶(prefrontal cortex, PFC)和杏仁核(amygdala, AMY)脑区受BDNFMet变异影响表达水平发生改变的基因和信号通路,从分子水平上进一步阐明BDNFMet变异引起这些变化的机制。此外,通过基因芯片的数据分析,我们发现,趋化因子信号CX3CL1/CX3CR1和细胞粘附信号PCDH1在BDNFMet变异小鼠海马组织内的表达水平发生了显著性改变,我们对其中所涉及到的功能变化和作用机制进行了更加深入的研究。这些研究不仅有助于加深我们对于BDNF胞内和胞外信号的深层次的理解,而且为针对BDNFMet变异导致的功能性障碍的治疗提供了新的研究思路。目的：1.研究BDNFMet变异对于空间记忆和工作记忆等高级神经系统功能的影响；2.利用基因芯片探讨BDNFMet变异导致脑解剖结构和功能异常的分子机制；3.研究趋化因子CX3CL1对BDNFMet变异导致的记忆障碍的潜在治疗效果：4.研究细胞粘附分子PCDH1的表达调控机制及其对突触可塑性调控的作用。方法：1.Morris水迷宫实验Morris水迷宫实验是测试动物空间学习记忆能力的一个经典的行为学实验模型,在本实验中用于检测BDNFMet变异对小鼠海马依赖的空间记忆的影响。实验分为隐蔽平台训练和空间探索测试两个阶段。在隐蔽平台实验中,进行连续6天的水迷宫获得训练,以每天小鼠找到平台所需时间长短来评价小鼠空间记忆的获得能力。第7天,将平台取走,进行水迷宫探索测试,记录1分钟内小鼠在目的象限活动的时间和穿越原平台象限的次数,作为评价小鼠对空间记忆的保存能力的指标。2.T迷宫自主交替实验T迷宫自主交替实验是测试小鼠工作性记忆的经典模型,在本文中用于检测BDNFMet变异对小鼠的工作记忆的影响。实验同样分为训练和测试两个阶段。在训练阶段,小鼠进行连续3天的自主交替行为训练。每只小鼠每天进行两个阶段的训练,每个阶段包括连续6次的自主交替行为训练。在测试阶段。将小鼠放入T迷宫主干壁,记录小鼠连续6次离开主干壁进入每个侧壁的次数。小鼠第一次进入两侧壁中任何一个侧壁都认为是正确的选择。在连续6次的选择中,小鼠交替进入两侧壁的次数除以总的选择次数即为小鼠正确选择的比率,以此作为评价小鼠工作记忆的指标。3.旷场实验本实验中利用旷场实验对小鼠的自主运动能力进行测试。旷场实验中,小鼠可自由活动10分钟,计算小鼠此时间内的运动距离作为评价其自发活动能力的指标。4.环境依赖的条件性恐惧记忆实验环境依赖的条件性恐惧记忆实验用来测试小鼠建立学习记忆不悦经历和环境暗示之间关联的能力。本实验中建立电击和环境偶联的条件反射。实验分为训练和测试两个阶段。训练阶段,进行3次的足底电击和环境的偶联。每次电击2秒,电流强度0.7毫安,每次电击之间间隔60秒。小鼠的不动行为定义为除了必须的呼吸运动以外完全的趴在一个位置静止不动。训练结束24小时后对小鼠进行恐惧记忆的测试。将小鼠放入其训练时的恐惧记忆实验箱,无任何足底电击情况下使其在实验箱中自由探索5分钟,记录并分析小鼠5分钟内的静止不动时间,以静止不动时间的百分比作为评价小鼠环境依赖的恐惧记忆是否形成的指标。5.实时定量PCR实验基础状态下剥离小鼠的脑区,：提取总RNA,分光光度计记录OD260/OD280同时经琼脂糖凝胶电泳检测质量合格后反转录成cDNA。采用SYBR Green荧光标记法实时定量PCR检测目的基因和内参β-actin的mRNA表达水平,2-ΔΔCT方法统计目的基因在不同基因型小鼠各脑区的表达情况。6.蛋白印迹实验基础状态下剥离BDNF+/Met、BDNFMet/Met和野生型小鼠的脑区,经裂解液裂解后提取总的蛋白,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白以及内参蛋白,经一抗和二抗标记后显色曝光,通过与内参蛋白作比较,检测目的蛋白的表达水平。7.脑立体定位埋管和微量注射实验将小鼠固定于脑立体定位仪,依据小鼠脑图谱选定的坐标,向双侧海马埋管至特定位置。待手术结束,小鼠恢复两周后,进行CX3CL1重组蛋白的定点微量注射,然后观察(1) CX3CL1对BDNFMet/Met小鼠海马依赖的空间记忆和恐惧记忆缺陷是否有改善作用；(2) CX3CL1是否能促进BDNFMet/Met小鼠海马的齿状回颗粒细胞层新生神经元的成熟和存活。8.溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)腹腔注射和免疫组织化学染色脑立体定位埋管手术两周之后,对BDNFMet/Met和野生型小鼠腹腔注射50mg/kg的BrdU,连续注射4天,每天一次。从最后一次腹腔注射BrdU算起,分别从第21天和27天起向海马脑区进行CX3CL1的定点微量注射,第28天将小鼠断头取脑切片,对背侧海马齿状回进行BrdU和NeuN的免疫组织化学双重染色,统计共染的细胞数目,以此观察CX3CL1是否能促进BDNFMet/Met小鼠齿状回新生神经元的成熟和存活。9.表达谱芯片杂交和数据分析本实验采用Illumina公司的Mouse WG-6v2.0表达谱芯片观察BDNFMet变异对小鼠各个脑区基因表达水平的影响。芯片杂交实验和初步的信号处理工作由上海伯豪生物技术有限公司,即生物芯片上海国家工程研究中心完成。之后我们进行了后续的差异基因筛选并通过Gene Ontology和KEGG数据库进行了信号通路的分析。结果：1. BDNFMet基因多态性的转录组分析和功能研究1.1BDNFMet变异导致基因剂量依赖的空间记忆和工作记忆损伤在水迷宫实验训练阶段,BDNF+/Met小鼠的逃避潜伏期与野生型小鼠相比没有显著性差别。而BDNFMet/Met小鼠在训练第5天和第6天的逃避潜伏期相对于野生型小鼠显著性增加,具有统计学差异。在探索实验中,无论是在目的象限停留的时间还是穿越平台象限的次数,BDNF+/Met小鼠与野生型小鼠相比都有降低的趋势,但并无统计学差异。而BDNFMet/Met纯合变异小鼠在目的象限的停留时间和穿越平台象限的次数与野生型小鼠相比都有显著性降低。在T迷宫实验中,BDNFMet/Met纯合变异小鼠在T迷宫自主交替实验中的正确选择的次数相对野生型小鼠显著性降低,而BDNF+/Met杂合小鼠的表现与野生型小鼠相比没有统计学差异。上述结果说明,BDNFMet变异会导致小鼠基因剂量依赖的空间记忆和工作记忆的损伤。1.2BDNFMet变异导致脑区特异性和基因剂量依赖的基因表达谱和信号通路改变利用Illumina表达谱芯片,通过比较BDNF+/Met、BDNFMet/Met与野生型小鼠海马、前额叶和杏仁核脑区中的基因组mRNA表达水平,我们检测出在BDNF+/Met小鼠的海马、前额叶和杏仁核脑区分别有148、116和150个基因的mRNA表达水平发生了显著性改变,而在BDNFMet/Met小鼠的海马、前额叶和杏仁核脑区则分别有767、449和476个基因的mRNA表达水平发生了明显改变。对差异表达的基因进行信号通路分析发现,三个脑区既存在各自不同的信号通路的变化,又存在共同调控的信号通路。说明不同脑区之间既有各自的独立性,又有相互的联系。1.3BDNFMet变异选择性降低小鼠背侧海马中CX3CL1/CX3CR1信号的表达水平实时定量PCR和Western Blot结果显示,与野生型小鼠相比,在BDNFMet/Met小鼠海马中,CX3CL1和CX3CR1两个分子的mRNA和蛋白表达水平显著降低。而在前额叶和杏仁核脑区,以上两种分子的mRNA表达水平在BDNpMet/Met小鼠和野生型小鼠之间并没有明显差别。1.4CX3CL1定点微量注射可以纠正BDNFMet/Met小鼠海马依赖的学习记忆缺陷向BDNpMet/Met小鼠海马脑区长期定点微量注射重组的CX3CL1蛋白后,分别在环境依赖的恐惧记忆实验和水迷宫实验中检测CX3CL1对BDNpMet/Met小鼠学习记忆的影响。结果显示,CX3CL1使得BDNFMet/Met小鼠在恐惧记忆测试阶段的不动时间显著增加。在水迷宫实验中,CX3CL1能明显增加BDNFMet/Met小鼠在目的象限的时间和穿越平台的次数。以上结果说明,CX3CL1能对BDNFMet/Met小鼠海马依赖的学习记忆缺陷起到改善作用。1.5CX3CL1能促进BDNFMet/Met小鼠海马齿状回新生神经元的成熟和存活BDNFMet/Met小鼠海马齿状回新生神经元的存活率相对于野生型小鼠明显降低。然而,向BDNFMet/Met小鼠海马齿状回部位长期定点微量注射CX3CL1能显著增加BrdU和NeuN共染的细胞数目,说明CX3CL1能够显著促进BDNFMet/Met小鼠齿状回新生神经元的成熟和存活。这些存活下来新生的神经元就有可能整合到了海马的神经环路当中,从而对学习记忆起到了改善作用。2. PCDH1参与介导BDNFMet变异导致的突触可塑性障碍机制的研究2.1PCDH1在BDNFMet/Met小鼠海马脑区中的表达水平显著性降低实时定量PCR和蛋白印迹结果显示,与野生型小鼠相比,BDNFMet/Met小鼠海马脑区中PCDH1基因的mRNA和蛋白的表达水平都显著性降低。而与PCDH1同家族的且在海马脑区高表达的分子,如PCDH7、PCDH8、PCDH9、 PCDH10、PCDH17、PCDH19和PCDH20等,在BDNFMet/Met和野生型小鼠海马脑区中的mRNA表达水平并无显著性差别。除此之外,SynCAM1、SALM3、 Nectin3、Cdh2、Nlgn1以及NCAM1等在突触形成和可塑性调控过程中发挥重要作用的突触细胞粘附分子在BDNFMet/Met和野生型小鼠海马脑区中的mRNA表达水平也没有显著性差别。2.2PCDH1在出生后小鼠脑发育过程中和成年期小鼠脑内广泛性的表达在出生后小鼠脑发育过程中,PCDH1蛋白表达水平逐渐提高,并且与突触后蛋白PSD95有着相似的表达模式。在刚出生的P0天,PCDH1在脑内有着相对较低的表达,而在第7天其表达水平则有显著性的增加,并在第21天达到一个表达的高峰值,并在成年期一直维持着较高的表达水平。此外,在成年小鼠脑内,PCDH1蛋白广泛性的表达于不同脑核团,如海马、前额叶、杏仁核、纹状体以及内嗅皮层等脑区都有较高的表达,而在下丘脑和小脑中的表达水平则相对较低。结论：本实验主要有以下几个发现和创新点：1. BDNFMet/Met纯合变异会导致小鼠空间和工作记忆的损伤,而杂合的BDNF+/Met变异对上述记忆的影响不甚明显。2.这是我们首次通过基因表达谱芯片研究BDNFMet变异引起海马、前额叶和杏仁核脑区结构和功能改变的分子机制,对于深入理解BDNFMet变异的作用机理具有深远意义。3. CX3CL1/CX3CR1信号通路异常可能是BDNFMet变异诱发海马学习记忆障碍的原因之一,且外源性的给予CX3CL1能促进BDNFMet/met小鼠海马齿状回新生神经元的成熟存活,进而对学习记忆起到改善作用。4.粘附分子PCDH1在脑内广泛表达,并且受BDNFMet变异影响,PCDH1在小鼠海马脑区中表达水平显著降低,并可能影响突触的形成。意义：我们的研究对于进一步深入的理解BDNFMet变异引起中枢神经系统结构和功能改变的机制,探讨新的针对BDNFMet变异所诱发的功能障碍的治疗方式具有重要的指导意义。