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目的构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,确定其转染效率;建立SD大鼠颈静脉分支颈动脉血管移植模型,对建立方法进行改进,并对新生内膜细胞来源进行研究;观察双位点shRNA靶向沉默Pik3cb对PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响和其对血管移植术后再狭窄防治作用。方法根据GenBank数据库提供的Pik3cb基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则,设计并合成6条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1,进行酶切鉴定和测序,经预实验后挑选出2条Pik3cb shRNA真核表达载体,分别命名为pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2。建立大鼠颈静脉分支颈动脉间置模型,并对建立方法进行改进,术后1d、3d、7d、14d、28d分别取材,组织切片行α-SM-actin和CD-34免疫组化分析新生内膜细胞来源。采用大鼠颈静脉分支颈动脉间置模型,通过PluronicF-127质粒缓释系统在血管吻合完成后进行局部RNA干扰。分6组:A组:正常对照组:25%Pluronic F-127组;B组:pU6-Pik3cb-shRNA-1组;C组:pU6-Pik3cb-shRNA-2组;D组:1/2(shRNA 1+shRNA 2)组;E组:pGenesil-1质粒错配shRNA组;F组:wortmannin阳性对照组。根据实验分组的不同,分别将200μl含有50μg shRNA质粒的Pluronic F-127凝胶,或50μg wortmannin,或空白Pluronic F-127凝胶均匀地涂抹在移植桥血管的周围。一组局部应用pGenesil-1质粒错配shRNA,于术后1d、2d、3d取材,快速冰冻观察转染效果。一组术后3d取材,实时荧光定量PCR和Western blot测定PI3K p110β亚单位mRNA的表达和其下游磷酸化Akt、mTOR和PCNA蛋白表达。另设1d、3d、7d、14d、28d五个观察点,每组30只SD大鼠,免疫组化检测磷酸化Akt308、PCNA表达的高低,TUNEL法检测凋亡细胞的数目;HE染色观察内膜厚度,新生内膜面积。结果成功构建2条大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体。转染移植静脉,中膜平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)转染效率达60%,内皮细胞转染效率达90%以上。成功建立大鼠颈静脉分支颈动脉间置模型并对手术方法进行了改进,通过α-SM-actin和CD-34免疫组化结果推断静脉桥血管新生内膜细胞主要来源于桥血管本身细胞或循环祖细胞。pU6-Pik3cb-shRNA和wortmannin转染后72 h Pik3cb mRNA和其下游效应分子磷酸化Akt308、磷酸化Akt473、磷酸化mTOR和PCNA蛋白表达均明显下调;转染组和阳性对照组mRNA相对表达量与正常对照组相比分别下降了70.3%、51.8%、59.9%和74.8%;转染组和阳性对照组Phospho-Akt(Thr308)蛋白表达量与正常对照组相比分别下降了88%、80.4%、85.6%和90.5%;转染组和阳性对照组Phospho-Akt(Ser473)蛋白表达量与正常对照组相比分别下降了77.8%、70.8%、74.7%和84.1%;转染组和阳性对照组Phospho-mTOR(Ser2448)蛋白表达量与正常对照组相比分别下降了73.4%、62%、70.5%和80.6%;转染组和阳性对照组PCNA蛋白表达量与正常对照组相比分别下降了61.3%、40.7%、53.3%和76.3%;各组正常对照和阴性对照相比均无统计学意义(P＞0.05)。免疫组化磷酸化Akt308显示各时间点正常对照组和错配质粒组内膜和中膜内侧阳性细胞较多;转染组和阳性对照组内膜和中膜内侧阳性细胞明显减少,在7d和14d减少最明显,与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。14 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.6%、0.81%、0.73%和0.53%,正常对照组和错配质粒组阳性面积百分比为1.72%和1.66%;28 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.72%、0.78%、0.77%和1.08%,正常对照组和错配质粒组阳性百分比为2.19%和2.01%;各时间点正常对照组和错配质粒组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。免疫组化PCNA显示各时间点正常对照组和错配质粒组内膜和中膜内侧阳性细胞较多;转染组和阳性对照组内膜和中膜内侧阳性细胞明显减少,与转染组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。28 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为0.64%、0.83%、0.72%和1.24%,正常对照组和阴性对照组阳性百分比为2.31%和2.53%;各时间点正常对照组和错配质粒组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。TUNEL法结果显示各时间点转染组和阳性对照组内膜和中膜内侧凋亡细胞明显增加;14 d时转染组和阳性对照组凋亡细胞阳性面积百分比分别为3.19%、2.56%、2.93%和3.64%,而正常对照组和错配质粒组阳性百分比为1.45%和1.33%;28 d时转染组和阳性对照组阳性面积百分比分别为2.62%、1.93%、2.28%和2.45%,正常对照组和错配质粒组阳性百分比为0.66%和0.84%;各时间点正常对照组和错配质粒组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。HE染色显示术后1～2 w新生内膜细胞增生最为明显,各时间点转染组血管内膜厚度、新生内膜面积均较正常对照组和错配质粒组明显减少(P＜0.05)。正常对照组在14 d时内膜厚度较1 d增厚了6.8倍,阴性对照组为6.6倍,而转染组在14 d时仅分别增厚了3.8倍、4.5倍和4.1倍;正常对照组在14 d新生内膜面积较1 d增加了5.2倍,阴性对照组增加了5.1倍,而转染组在14 d时仅分别增加了2.8倍、4.6倍和3.1倍。阳性对照组内膜厚度和新生内膜面积在14 d之前一直处于低水平,14 d后因药物效应减弱,内膜厚度和新生内膜面积逐渐增加。结论构建的质粒载体成功进行RNA干扰实验,靶向Pik3cb的shRNA下调PI3K-Akt-mTOR信号通路,抑制平滑肌细胞增殖,促进平滑肌细胞凋亡,有效减轻移植血管新生内膜增生,防止移植血管再狭窄形成,为抑制血管移植术后桥血管新生内膜增生的基因治疗提供了新的思路。