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乳腺癌是危害女性健康的第一杀手,从世界范围来看,它占女性肿瘤的18%。雌激素受体(ER,Estrogen Receptor)在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用,特别是在体内复杂的信号通路交联中,ER可能扮演着桥梁的作用。本论文重点研究了ERα的转录因子和ERβ发生磷酸化的位点及其对应的激酶。首先构建了不同长度的ERα启动子缺失突变体,以约50bp为单位,共构建了46个突变体,然后在ZR75-1、Mcf-7和MDA-MB-231这三种乳腺癌细胞中测定了46个ERα启动子缺失突变体的活性。以最长的ERα启动子缺失突变体为报告基因,筛选了前期回收到的转录因子,通过多次筛选,一共获得了13个有价值的转录因子,TL03(Transcriptional factor L03)等。在Mcf-7和ZR75-1细胞中,测定了其中8个转录因子(TJ02等)对ERα转录水平和蛋白表达水平的影响。又对其中5个转录因子(TO08等)在ZR75-1中做了初步的定位,定位的范围大约在500bp以内。ER介导的转录活性,主要是通过结合雌激素和发生磷酸化这两种方式实现的。鉴于ERα的磷酸化研究相对比较透彻,本实验采用ERα与ERβ蛋白序列同源比对的方法,对ERβ的磷酸化位点以及其对应的激酶做了详细的研究。首先通过软件比对分析了ERα和ERβ的蛋白序列,发现两者同源性可达44.13%,由此推测,与ERα磷酸化位点相对应的ERβ位点,可能就是ERβ发生磷酸化的位点,最终选择了6个ERβ可能发生磷酸化的位点(ERβThr-73等)。通过重组PCR的方法,构建了6个ERβ点突变体,将对应位置的氨基酸突变为Ala。在293T细胞中,通过活性测定,发现ERβSer-75在ERβ介导的转录活性中发挥重要作用。在网站上预测了ERβ可能发生磷酸化的位点及其对应的激酶,对应于已经确定的6个位点,一共选定了21个激酶,然后在293T细胞中筛选了这21个激酶,最后确定了KD10(Kinase D10)和KA21加以研究。通过实验研究,最终确定了KD10的磷酸化位点为ERβSer-200,KA21的磷酸化位点为ERβSer-135和Ser-264。ER在体内发挥作用是一个复杂的信号交联过程,从细胞膜上受体结合配体到核内基因的表达要经过多层次的信号传递,而这种信号传递很多就是通过磷酸化完成的。鉴于ER在研究乳腺癌发病机制中的重要性,本论文研究的直接与ER相关的转录因子与激酶具有重要意义。