研究背景与目的:肺纤维化是一种长期的、渐进性的、致死性的肺病。是由多种原因引起的肺泡炎症,肺泡持续性损伤并过度修复,致使肺间质纤维过度沉积形成局域性的瘢痕组织。这种过程是不可逆的并且进展迅速,可由环境粉尘、药物等致病,尚有一些自发性肺纤维化患者发病机制不明确。肺纤维化的治疗手段有限,除肺移植外没有根治的方法。从确诊到死亡的生存中位数仅仅3-5年。作为孤儿药物的吡非尼酮是唯一在说明书上标明肺纤维化适应症的药品。但吡非尼酮存在较多的消化系统和神经精神系统的不良反应使其临床使用受限。目前缺少肺纤维化治疗药物从另一方面说明其药物作用靶点尚未发现,因此,发现疗效更好,安全性更高的肺纤维化治疗药物和可能的药物治疗靶点一直以来是药学科研人员的努力方向之一。肺纤维化以咳嗽咯痰,后期出现进行性加重的呼吸困难等为主要临床表现,同时又具有慢性经过或反复发作等特点,故中医学将其列入"肺痿"、"肺痹"等病症中。现代中医通过长期研究认为:痰热血瘀,阻滞肺络,致肺失清肃,气机闭塞为肺纤维化的主要病机。临床治疗采用清热解毒、活血化瘀等法治疗对肺纤维化有一定的预防和治疗作用。中药虎杖有着悠久的药用历史,《药性论》、《本草拾遗》等中药学经典著作中都有其在药学应用方面的记载。虎杖,为寥科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根和根茎。味微苦,性微寒。归肝、胆、肺经。具有利湿退黄,清热解毒,散瘀止痛,止咳化痰的功效。现代研究显示虎杖具有抗肺纤维化作用。虎杖苷是虎杖发挥抗肺纤维化作用的主要成分之一。为进一步明确虎杖苷抗肺纤维化的作用以及探讨其可能的作用机制,发现潜在的药物作用靶点,本实验复制博来霉素诱导肺纤维化的小鼠模型,从动物整体水平观察虎杖苷的治疗作用,观察其对肺组织转化生长因子(transforming growth factors,TGF-β)的干预作用,从而为虎杖苷治疗肺纤维化的应用提供更多的证据。方法:1.复制博来霉素诱导肺纤维化的小鼠模型对比气管内滴注和腹腔注射博来霉素(B1eomycin,BLM)两种制备肺纤维化模型的优劣,确定最佳造模方式。健康雄性C57BL/6小鼠,7周龄,常规饲养7天,按体重随机分成11组,每组5只。气管内滴注给药方式6组,分别为3天组、7天组、14天组、21天组、28天组和空白对照组,气管内滴注博来霉素生理盐水溶液,剂量相当于博来霉素效价2 mg/kg体重,以实验开始之日为第0天,于给药后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天摘眼球采血后处死动物,收集血清、肺泡灌洗液、全部肺组织。空白组同法滴注等体积生理盐水。腹腔注射给药方式5组,即7天组、14天组、21天组、28天组和空白对照组。以实验开始之日为第0天,腹腔注射0.1 mg/mL博来霉素生理盐水溶液,剂量相当于博来霉素效价1.5 mg/kg体重。隔天一次,持续两周,共计8次,7天组共注射4次。分别于第7天、第14天、第21天、第28天处死动物,摘眼球采血后处死动物,收集血清、肺泡灌洗液、全部肺组织。空白对照组腹腔注射等体积生理盐水。以肺组织病理学特征确定最佳造模条件。2.虎杖苷抗肺纤维化的作用根据上一步实验结论,采用气管内滴注博来霉素生理盐水的方法复制小鼠肺纤维化模型。健康雄性C57BL/6小鼠,7-8周龄,适应性饲养7天,按体重随机分为5组,正常对照组、模型组、阳性药吡非尼酮组、虎杖苷预防组、虎杖苷治疗组,每组5只。正常对照组气管内滴注灭菌生理盐水,其他组按2 mg/kg体重剂量气管内滴注无菌博来霉素生理盐水溶液。.阳性药对照组、虎杖苷预防组(171 mg/kg体重)造模后第2天开始灌胃给药至第28天,虎杖苷治疗组(171 mg/kg体重)造模第7天开始灌胃给药,空白对照组和模型组造模后第2天开始灌胃等体积纯水至第28天。以Masson染色法改变程度判断虎杖苷对肺纤维化的保护作用;以羟脯氨酸含量指示在肺纤维化过程中胶原的变化;肺泡灌洗液中炎性细胞计数推测肺纤维化过程中炎性反应的变化;用小鼠TGF-β蛋白芯片检测小鼠肺组织中TGF-β1/2/3的含量。结果:1.Masson染色显示,博来霉素气管内滴注法在造模后第7d即出现炎性细胞增多,散发性胶原纤维增多;第14天出现小面积胶原纤维沉积灶;第21天出现多处斑块状胶原纤维沉积灶,面积较大;第28天的纤维化程度与第21天接近,略有加重;从第7天致第28天可见明显的肺纤维化渐进过程、腹腔注射组造模后第7天散发性出现巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞增多;第14天肺间质出现纤维胶原增多迹象;第21天肺间质散发性出现少量胶原纤维增多;第28天与第21天相似,未见斑块状胶原纤维沉积灶。2.与空白对照组的肺组织相比,模型对照组的肺组织结构破坏严重,呈严重肺纤维化病理表现。虎杖苷预防组肺纤维化程度明显减轻,表现为散发性小面积胶原纤维沉积。与预防组相比虎杖苷治疗组的肺纤维化改善程度弱于预防组,纤维化面积大于预防组,与模型对照组比较具有改善作用。阳性对照药物吡非尼酮减轻了肺纤维化程度,改善作用与虎杖苷治疗组无明显差别。3.羟脯氨酸含量测定和肺泡灌洗液巨噬细胞计数结果均显示该项结果与肺纤维化程度无相关性(P>0.05)。结论:本实验表明博来霉素气管内滴注可诱发明显的肺纤维化,且与临床肺纤维化发病特征相似。虎杖苷能明显减轻小鼠肺纤维化的程度,对肺纤维化具有潜在的治疗作用。