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MicroRNAs(miRNAs)是长度为21-25nt非蛋白质编码的小RNAs,它可以调节有关的基因的表达,从而调控生物体的生长、发育和新陈代谢等过程。miRNAs最初在Caenorhabits elegan线虫中发现,最近在很多病毒中也发现有miRNAs的存在。为了研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)miRNAs的功能,本实验分别采用生物信息学预测法和高通量测序的方法鉴定了BmNPV基因组编码的miRNAs;通过在线软件预测了其可能作用的靶基因,并对2个已知的BmNPV miRNAs序列m1和m2进行了功能分析。主要结果如下。(1)BmNPV基因组编码的miRNAs前体的预测与PCR验证。利用VMir软件对BmNPV全基因组进行扫描,通过对所得序列的评分及发夹结构分析,并且排除位于蛋白编码区的序列,最终得到7条可能由BmNPV基因组编码的miRNAs候选前体序列。以家蚕杂交种S16·S17×A1·A16幼虫为实验材料,用浓度5×10~7 PIB/mL BmNPV添食感染五龄起蚕,72 h后取血淋巴提取总RNA,通过RT-PCR鉴定出5条可能由BmNPV基因组编码的miRNA前体分子。进一步分析5条前体分子的发夹结构,并用RT-PCR验证miRNA成熟体序列,结果在5个前体分子上共扩增出6条和病毒基因组序列一致的成熟体序列,它们分别位于不同的ORF之间,其中2条序列为正向转录序列,4条为反向转录序列。我们认为这6条成熟体序列是BmNPV基因组编码的miRNAs。通过定量分析发现前体序列和成熟体序列随时间增量表达。(2)BmNPV基因组编码的miRNAs前体的高通量测序。采用高通量测序的方法在BmNPV基因组中检测到14条miRNAs。但利用RT-PCR的方法只鉴定出其中7条miRNAs,它们分别位于不同的ORF中,其中3条为正向转录序列,另外4条为反向转录序列。(3)BmNPV基因组编码的miRNAs在病毒基因组上的靶基因预测。利用在线靶基因预测程序RNA hybrid和RNA 22共同预测获得13条BmNPV miRNAs在病毒基因组上的靶基因。结果获得28个可能的靶基因,其中4个是编码囊膜蛋白的基因,3个是编码衣壳蛋白的基因,5个分别是编码lef-5、lef-6、SOD、Polyhedrin以及GP37的基因,16个为非注释基因。由此我们推测BmNPV编码的miRNAs可能参与并调节了病毒感染宿主的过程。(4)BmNPV miRNA序列m1和m2的功能分析。利用RNA hybrid软件预测2个已知的BmNPV miRNA序列m1和m2的靶基因,PCR扩增m1、m2的前体序列和其预测靶基因的3’-UTR序列,分别构建表达miRNA的pcDNA重组质粒和表达靶基因3’-UTR的pGL重组质粒,共转染家蚕BmN细胞。通过双荧光素酶报告基因检测系统分析,过表达m1使pGL-38k 3’-UTR的表达下调14% ;过表达m2使pGL-Polyhedrin3’-UTR和pGL-ODV-EC27 3’-UTR的表达分别下调9.8%和9.2%。结果显示38k与Polyhedrin、ODV-EC27可能为m1与m2的靶基因。