ZwittermidnA是自然界中第一种被发现的线性氨基多元醇类抗生素,主要由蜡状芽胞杆菌群产生,包括Bt。ZwittermidnA不仅能够抑制多种植物病原菌和低等藻类的生长,而且对Bt杀虫晶体蛋白的杀虫具有广谱的增效活性。自1994年该物质被鉴定以来,经过国内外多个实验室的共同努力,zwittennicin A的完整基因簇最终于2011年得到完善,通盖合成、免疫、转运、调控等70化左右的基因序列,位于两个转座基因之间。2009年kevany等提出zwittennicin A的合成途径模型,但其中某些关键基因的功能只是基于生物信息学推测,还需在遗传学和生物化学水平上进一步验证,本研究的部分内容由此展开。此外,Bt杀虫制剂及化作物的广泛应用一定程度上提高了该物质的应用潜力,但化制剂生产过程中zwittennicin A的产量控制缺乏有效的监测,关键在于没有标准品可用并且不存在有效的定量方法。此外,今后如果要开展该物质的代谢调控研究,也需要有标准品存在。基于此,本研究的部分内容,则是围绕如何制备zwittennicinA的标准物质并建立一种快速有效的定量方法展开的。2000年以后,国内外已报道的zwittennicin A纯化方法,主要是先采用两遍阳离子交换柱层析得到粗品,然后经HPLC制备zwittennicinA的纯品,但是该方法得到的zwittermicin A样品纯度很低,同时这些纯化方法也不适用于发酵样品中zwittennicinA含量的准确定量。本研究基于已报道的纯化方法,结合自己的探索,利用阳离子交换层析、桂胶柱层析和高效液相色谱技术制备得到75.25%纯度(HPLC峰面积比例)的zwittennicinA标品125mg,97.15%(HPLC峰面积比例)纯度的zwittermicin A 3.2mg。此外,本研究基于阳离子交换技术,利用得到的标准品,分别采用液相和质谱手段对多个蜡状芽胞杆菌的发酵样品进行了定量研究。Zwittennicin A定量瓶颈得解决,大大方便了zwittennicin A的生物合成研究。本研究基于前人的结果,结合自己的研究兴趣,分别对zmaS、zmaM基因的功能及zwittennicinA的释放机制开展了一些研究工作。在Bacillus UW85的基因组中,zmaS基因位于zwittermicin A合成基因簇内部,紧邻kanosamine的合成基因簇,推测编码一种PPTase,负责催化apo-ACP和apo-PCP转换成holo-ACP和holo-PCP。本实验室前期研究发现,该基因被敲除后,突变体的抑菌圈显著变大,但zwittennicinA仍然产生;其后,将该基因与其邮连的kanosamine合成基因簇偶联异源表达,发现zmaS基因能够负调控kanosamine的合成。本研究通过对zmaS突变体UW86的kanosamine和zwittennicin A产量定量分析发现,UW86的kanosamine产量比出发茵提高15.18倍左右,而其zwittermicin A的产量只有出发菌的1/40。因此本研究确证了zmaS对kanosamine生物合成的负调控作用,但zmaS是W何种形式调控该抗生素的生物合成呢?本研究通过序列分析发现,zmaS与kanosamine的正调控基因kauR紧邻且阅读框反向,在两个基因中间存在一个能量值很高的发夹结构,我推测zmaS是影响了kanR的转录间接影响了kanosamine的产量。于是,本研究构建了zmaS及zmaS#(zmaS的突变基因)超表达突变体,但定量结果没有发现zmaS对kanosamine明显的负调控作用,还需要进一步研究。由于zmaS编码一种Sfp型PPTase,且zmaS突变体的zwittermicin A产量大大下降,因此有必要确证zmaS的生化功能,于是本研究通过诱导表达zmaS基因,以Sfp蛋白为正对照,采用体外催化的方式,最后证明zmaS是一种有功能的PPTase编码基因。zmaM基因也位于zwittermicin A合成基因簇内部,推测编码一种双功能膜蛋白,C-端具有转运子结构域,N-端具有化酶结构域,分别负责zwittermicinA前体物的转运与后修饰。本实验室前期研究分别将zmaM基因的转运结构域及zmaM全基因同框缺失,但两种突变了都还产zwittermicinA,且它们的抑菌能力与野生型没有太大差别,这似乎预示zmaM与zwittermicin A的合成不具有相关性,同时揭示了zwittermicinA的合成机制注定应该有新的解释。本研究通过确定正确的取样点,即内生芽胞已经形成、母细胞尚未破裂时期,将野生型和两个突变体的抑菌表型做出了明显差异,同时对两个突变子的zwittermicm A定量分析发现,BMB1354和BMB1355的zwittermicin A产量只有出发菌UW85的60%左右,但前两者之间没有明显差异。因此本研究认为zmaM确实与zwittermicmA的生物合成直接相关。由于UW85的基因组没有公布,本研究根据zwittermicinA产生菌YBT-1520的基因组搜索zmaM类似的编码基因,找到了一些相似性比较大的基因,并在UW85中进行了扩增验证,在一定程度上回答了UW85中可能存在的zmaM互补机制。经典的抗生素合成释放机制是通过I型Te结构完成的,在zwittermicin A的合成基因簇中也存在类似的I型Te结构,但zwittermicmA却不是通过该结构释放的,信息学预测推测它是通过基因簇内部一种单加氧酶催化释放,同时敲除实验也证实了该单加氧酶编码基因与zwittermicin A生物合成相关,但缺乏生物化学义面的证据。此外,关于zwittermicin A化学合成的研究报道已经有很多,但得到的zwittermicin A对映体或截短化合物都失去了该物质的抑菌和增效活性,因此关于zwittermicin A活性基团研究也需要一些实验证据支持。本研究拟通过构建一种由I型Te结构释放zwittermicin A的突变体,以期得到具有活性的zwittermicin A结构类似物,同时为单加氧酶的生化功能研究提供特异性底物,从而回答上述研究中存在的困惑。本研究利用同源双交换技术成功构建出突变体,并筛选出H种平板表型的菌落。通过对草生欧文氏杆菌的抑菌表型实验发现,BMB1964和BMB1965都有明显的抑菌能力,BMB1963抑菌能力不明思。本研究重点分析了BMB1965活性物质产生情况,发现这株菌不能产生预测中的zwittermicin A结构类似物,但它的zwittermicin A产景比出发菌提高了7.25倍。本研究推测Te的引入加速了与zwittermicinA相伴而生的代谢物B的产生,从而间接促进了该物质的产生。限于时间原因,另两株表型突变体没有深入测试。综上所述,本研究主要取得以下研究结果：一方面从分离纯化水平,建立了一套制备zwittermicin A高纯度标品以及快速定量发酵样品中zwittermicin A含量的方法；一方面从定量水平、遗传学水平及生物化学水平,阐明了zwittermicin A生物合成基因簇中部分关键基因的功能。