研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是非常普遍和病死率极高的恶性肿瘤,位居我国恶性肿瘤死亡率第二位,严重危害人民健康。流行病学研究表明慢乙肝病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染是肝癌发生的主要危险因素,其次酗酒、黄曲霉素食品污染都和肝癌密切联系。分子生物学研究表明肝癌发生发展、转移复发是一个多步骤多因素过程,涉及细胞内一系列复杂变化,其中肿瘤血管生成起重要作用。此外,肝癌的发病隐匿,不易早期诊断,等患者出现典型症状往往已经发展到肝癌中晚期,失去了有效治疗时间。最近研究表明,目前肝癌首选治疗方法仍是手术,但即使早期手术切除的小肝癌,5年内仍有50%左右的转移复发率。因肝癌的发生发展是多因素共同参与,临床上治疗肝癌的许多药物作用机制靶向性过强,仅仅针对肝癌发生机制中某一因素,适应人群偏少,且患者极易出现耐药和不同程度毒副反应,总体上不能获得理想治疗效果。因此,研发新的抗肝癌药物,对我国这样一个肝癌高发国家而言,有着极其重要的理论意义和应用价值。组织蛋白酶是一类在酸性PH环境中被活化的溶酶体蛋白酶,属于半胱氨酸蛋白酶,在人类基因组中,11种不同的蛋白酶分别被编码为组织蛋白酶B, C, F, H, K, L, O, S, V, W, X (Z)。1986年,Kirschke首次从牛的脾脏中提取出组织蛋白酶S(Cathepsin S, CTSS/CatS),并证实其属半胱氨酸蛋白水解酶,主要分布在脾脏、淋巴结、心脏、抗原提呈细胞,与Cat L、 Cat H、Cat B分别有57%、41%、31%的序列同源性。CTSS是最重要的蛋白酶之一,正常情况主要在淋巴器官表达。CTSS在人类各种癌症发现过表达,如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胰腺癌等。虽然CTSS主要位于溶酶体内,越来越多证据表明,它可以易位到细胞表面,分泌到细胞外环境,参与调节细胞凋亡,降解动脉细胞外基质(ECM)粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等大分子和基质金属蛋白酶-2(MMP-2),同时释放基质衍生的生长因子,促进新生血管生成,加速肿瘤细胞浸润和转移。此外,靶向抑制CTSS表达可显著抑制肿瘤血管生成、腺癌模型侵袭和血管生成。Claire Ward等发现靶向抑制CTSS与抗VEGF有协同作用。因此,以VEGF/VEGFR为靶点,研发新的血管生成抑制剂已成为肝癌生物治疗的一个热点。我国的中药资源丰富,许多动植物中提取的生物活性成分经研究证明具有抗肝癌血管形成作用,并在临床广泛应用。所以,寻找和开发新的生物活性成分,探索其抗肝癌血管形成机理,能为肝癌抗血管治疗提供新的理论和实验证据。基于本实验组前期研究基础,我们选择蜂毒素单体(蜂毒的有效活性成分)作为了研究对象。蜂毒素(Melittin)是蜜蜂毒液中的主要成分,由26个氨基酸组成的两性肽。研究表明蜂毒能诱导细胞膜结构改变,包括小孔形成、融合和囊泡。研究表明蜂毒素具有多种作用,包括抗菌、抗病毒和抗炎等作用。研究证实蜂毒素可诱导肿瘤细胞周期阻滞,抑制其增殖和凋亡。然而,蜂毒素抗癌作用机制尚未完全阐明。本课题组前期研究证实蜂毒素能抑制HCC细胞增殖和肿瘤生长。另外,在MHCC97-H细胞沉默CTSS基因显著抑制血管内皮生长因子分泌和人脐静脉内皮细胞管状结构形成。提示血管内皮细胞在形成血管的几个关键环节可能和蜂毒素抑制作用有关。据以上研究我们推测,蜂毒素可能靶向作用于CTSS,抑制抗血管生成、肿瘤转移,但其作用机制仍需进一步探讨。研究目的：(1)研究沉默CTSS是否影响MHCC97-H细胞的生物学功能,并进一步探讨蜂毒素是否通过调控CTSS抑制肿瘤生长和肝癌血管形成；(2)揭示在蜂毒素作用下,探讨CTSS与VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2通路中相关蛋白相互调节机制,明确对肝癌血管形成的机制。研究方法：(1)通过Western-blot和RT-PCR实验筛选高表达CTSS的MHCC97-H肝癌细胞株；(2)利用慢病毒感染的方法,制备shRNA-CTSS/MHCC97-H稳定株；(3)通过体外细胞克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术分析实验、Transwell chamber实验和划痕实验观察shRNA-CTSS对MHCC97-H生物行为学的影响；(4)利用体外细胞克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术分析实验、Transwell实验、划痕实验和ELSIA实验观察稳定转染的MHCC97-H细胞株,在不同浓度的蜂毒素作用下,对增殖、凋亡、周期、细胞活性和细胞迁移的影响；通过Western blot实验观察蜂毒素能否通过调控CTSS,明确和VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2信号通路中相关蛋白存在的作用环节及机理；(5)合成CTSS-RNA,瞬间转染人脐静脉细胞,利用Transwell实验、内皮细胞小管形成实验,观察不同浓度的蜂毒素作用下对人脐静脉细胞浸袭和小管生成的影响；(6)建立裸鼠肝原位移植瘤模型,采取小鼠腹腔途径给药的方法,分别设立对照组(注射PBS)、蜂毒素处理组(80 mg/kg/d),观察各组间肿瘤体积大小和血管密度等差异,评估蜂毒素体内抗肿瘤血管形成效应。研究结果：1.筛选出高表达CTSS的MHCC97-H细胞株。采用RT-PCR和Western-blot检测8种细胞株CTSS的表达情况。结果显示,MHCC97-H细胞CTSS表达最高,其次为BeL-7402和MHCC97-L、 SMMC-7721、Hep3B, LO2、Huh7和HepG2表达偏低。2. shRNA-CTSS/MHCC97-H稳定株和生物学。观察shRNA-CTSS有效沉默MHCC97-H细胞CTSS基因的表达,影响其细胞周期和凋亡,抑制克隆形成、迁移和浸袭。3.蜂毒素抑制Mock/MHCC97-H稳定细胞株生长、侵润和迁移。实验结果证明,和shRNA-CTSS/MHCC97-H相比,蜂毒素明显抑制Mock/MHCC97-H生长、克隆形成、VEGF分泌和浸袭能力(P<0.05)。4.蜂毒素调控Mock/MHCC97-H细胞VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2信号通路中相关蛋白的表达。Western-blot实验结果显示,蜂毒素明显抑制Mock/MHCC97-H细胞CTSS、VEGF-A、Ras、p-Raf、p-MEK1、p-ERK1/2蛋白的表达。5.蜂毒素抑制]SUVECs小管形成和侵袭CTSS-RNA使CTSS在HUVECs中过表达。和Mock-HUVECs相比,蜂毒素能明显抑制CTSS-HUVECs小管形成和通过Matrigel的侵袭能力(P<0.05)。6.蜂毒素抑制裸鼠肝原位移植瘤的生长和肿瘤血管形成。和对照组相比,蜂毒素明显抑制Mock/MHCC97-H组裸鼠瘤体积和CD34的表达,也明显抑伟CTSS、VEGF-A、Ras、p-Raf、p-MEK1、p-ERK1/2蛋白的表达。研究结论：沉默CTSS明显影响MHCC97-H细胞的生物学行为；蜂毒素可能通过调控CTSS,阻断VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2信号通路,抑制肿瘤生长和肝癌血管生成,提示蜂毒素可能是CTSS的抑制剂,有望成为一种潜在的治疗肝癌药物。