研究背景:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是位居第二位的泌尿系统肿瘤。肾癌的死亡率在过去的10年内稳步增长,严重威胁人类的生存健康。按照病理检测结果,肾癌包含多个亚型,而其中有三种亚型的比例可达90%:包括人肾透明细胞癌(clear cell RCC),乳头状肾细胞癌(papillary RCC)和嫌色细胞癌(chromophobe RCC)。人肾透明细胞癌是最常见的肾癌亚型,常发生在近端小管,其发生率占肾癌的75%左右。但目前肾癌发生的分子病理机制尚不完全清楚。从已有研究来看,肾癌的分子病理机制是一个综合性的生物过程,这可能涉及到逐步积累的基因突变、基因组不稳定性、表观遗传变化和异常表达的蛋白质编码基因和非编码基因。值得注意的是,癌症基因组学的发展为探索肾癌分子病理机制提供了前所未有的信息。其中,非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)在调控癌症发生过程中的作用近年受到普遍关注,其也参与调控肾癌的发生过程。基因组学研究结果显示,只有约1%～2%的人类基因有蛋白编码功能,而大于90%的基因携带非蛋白编码信息,可以合成ncRNAs而发挥其它功能。按照功能的不同,这些ncRNAs大致可分为两大类:管家ncRNAs和调节ncRNAs。管家ncRNA,如转运RNA、核糖体RNA等,在基因的转录、转录后以及翻译过程中起作用。而调节ncRNAs在基因的转录、翻译等过程中起调控作用。长链非编码RNAs(long non-coding RNA,lncRNAs;长度大于200nt)是近期发现的调节性ncRNAs,其可以通过多种方式影响蛋白编码基因的表达,既有顺式调控作用也有反式调控作用。目前,研究表明多种lncRNAs参与癌症发生、演化过程,在影响癌细胞增殖、凋亡、迁移和转移等生物活动中发挥作用。而lncRNAs发挥作用的方式通常是基因转录水平和转录后水平调控,发挥促肿瘤或抑制肿瘤的作用。lncRNAs与肾脏关系的研究尚属于初期,但其在肾脏发育和肾脏疾病发生中的作用已经得到有力的证明。在肾脏的生理或者病理状态下,研究者观察到了lncRNAs水平的改变。利用基因芯片和定量PCR技术,研究者发现肾癌组织大量的lncRNAs表达上调或者下调。而且,一些lncRNAs与肾癌发生的密切相关性已经得到证实。CCAT1(Colon cancer-associated transcript-1)是新近发现的一种lncRNA,含有2628个碱基对,CCAT1基因位于8q24.21染色体。起初,研究者在结肠癌中发现CCAT1表达显著上调。在随后的研究中陆续发现,CCAT1作为促癌基因,参与胃癌、肝癌、胆囊癌的肿瘤发生过程。然而,CCAT1在肾癌发生过程中的作用尚不明确。癌细胞无限增殖是癌症发生的关键步骤,而在这个过程中凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)的作用功不可没。Livin(也称为 ML-IAP 或KIAP)是IAP家族的一个成员。可以通过抑制凋亡相关信号通路,发挥抗凋亡作用。Livin是一个39kDa的蛋白质,由一个单独的BIR结构域和一个RINC指结构域。BIP结构域是由约70个氨基酸残基组成的锌指结构结合位点,其中心可以与保守的富含半胱氨酸和组氨酸的残基连接,对Livin抗凋亡活性非常重要。Livin在一些恶性肿瘤中表达上调是维持癌细胞存活的关键因素之一。Livin在肾癌发生中的作用也已经得到肯定。国内外文献检索显示,Livin基因序列在正常脏器组织中基本无表达无分布,或者表达量极低,但是在胚胎组织和恶性肿瘤组织中表达量高。Livin可以分布于肿瘤细胞的细胞核,也可以分布于细胞质中。Livin的表达分布还具有一定的组织特异性,其在肺癌、胃癌、肾癌及膀胱癌等组织中表达量较其他恶性肿瘤组织丰富。研究证实其与肾癌组织的恶性程度和不良预后有关联性。国内外多位学者针对Livin序列设计出其干扰序列来阻断肾癌细胞内的表达,发现干扰后的肾癌细胞增殖能力下降、细胞凋亡比例增高。目前虽然尚不十分清楚其在抗肿瘤凋亡作用的详细机制,但Livin基因已然成为研究者们的热点议题,并设想其可作为将来治疗恶性肿瘤尤其是肾癌的有效靶点,设想其将来会为恶性肿瘤尤其是肾癌的治疗带来新的突破。笔者长期从事肾癌的临床和基础科研工作,我们在前期实验中发现Livin蛋白表达较高的临床肾癌组织标本,尤其是在恶性程度较高的组织中,PCR检测其CCAT1表达往往偏高,我们借此推测肾癌组织尤其是高度恶性的肾癌组织中CCAT1序列和Livin蛋白之间可能存在某种调节机制或相互作用机制。除了基因转录和转录后水平调控,lncRNAs还可以直接结合蛋白质,通过与蛋白的结合增加蛋白降解或者稳定蛋白水平,参与调控肿瘤发生过程。同样作为促肿瘤因子的CCAT1和Livin蛋白之间是否存在相互作用是本课题的研究重点。因此本课题将进行如下三项研究内容,探讨lncRNA CCAT1和Livin蛋白在肾癌组织和肾癌细胞系中的表达分析、二者之间的调控关系或相互作用关系,以及它们在肾癌发生中的作用及机制。研究目的:1.探讨CCAT1和肾癌发生的相关性。即:CCAT1是否可以调控肾癌细胞的增殖和凋亡,是否可以影响荷瘤鼠移植瘤的生长。2.探讨CCAT1和Livin蛋白在肾癌组织及细胞系中的表达情况和二者之间的作用关系,即:CCAT1是否可以调控Livin蛋白的水平及调控机制。3.探讨CCAT1对Livin蛋白的调控作用是否达到或参与其对肾癌细胞的增殖和凋亡的调控作用。实验方法:1.采用实时定量PCR检测肾癌组织或肾癌细胞中CCAT1的表达量。2.通过western blot检测肾癌组织或肾癌细胞中Livin、Bcl-2、Bax、caspases3/7/9蛋白表达量。3.采用MTT法检测肾癌细胞的增殖程度。4.采用TUNEL法及流式细胞仪检测细胞凋亡情况。5.通过肾癌细胞转染CCAT1干扰质粒(命名为si-CCAT1),观察si-CCAT1对肾癌细胞活性和凋亡的影响。通过肾癌细胞共转染si-CCAT1和Livin过表达载体(命名为 pcDNA3.1-Livin,下文简述为 pcDNA-Livin),探讨 pcDNA-Livin是否逆转si-CCAT1的促凋亡作用。做为对照,通过肾癌细胞转染CCAT1过表达质粒(命名为pcDNA3.1-CCAT1,下文简述为pcDNA-CCAT1),观察对肾癌细胞活性和凋亡的影响。通过肾癌细胞共转染pcDNA-CCAT1和Livin干扰质粒(命名为si-Livin),探讨si-Livin是否逆转pcDNA-CCAT1的促增殖作用。6.采用RNApull-down实验和RNA结合蛋白免疫沉淀实验,通过检测与CCAT1结合的Livin蛋白水平和与Livin蛋白结合的CCAT1水平,探讨CCAT1和Livin蛋白的相互作用。分别以蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)和蛋白酶体抑制剂(MG132)干预786-0细胞系后western blot检测Livin蛋白水平。在过表达CCAT1后的786-0肾癌细胞中,再分别以蛋白合成抑制剂(CHX)和蛋白酶体抑制剂(MG132)干预,western blot再分别检测其Livin蛋白水平。7.通过构建CCAT1-RNAi慢病毒载体(LV-sh-CCAT1)并转染至786-0肾癌细胞系,建立786-OLV-sh-CCAT1稳转肾癌细胞系。将786-OLV-sh-CCAT1稳转肾癌细胞系进行裸鼠皮下移植,观察CCAT1沉默对肿瘤生长的影响。实验结果:1.肾癌组织和肾癌细胞系中CCAT1表达水平及Livin蛋白表达水平。分别采用荧光定量PCR法和western blot法检测临床肾癌组织样本和与之配对的癌旁组织中CCAT1表达水平和Livin蛋白表达水平。结果发现,肾癌组织中CCAT1表达和Livin蛋白表达较癌旁组织显著。两种人肾透明细胞癌细胞系786-0和Caki-1中的CCAT1表达水平和Livin蛋白表达水平也较正常细胞显著(P<0.001)。2.CCAT1表达与肾癌临床特征的相关性分析CCAT1高表达(表达水平为癌旁组织的3.916倍以及上)与患者肿瘤大小、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。但与患者的性别、年龄、肿瘤分级、肿瘤分期及远端转移没有相关性(P>0.05)。3.转染si-CCAT1或pcDNA-CCAT1对人肾透明细胞癌细胞增殖和凋亡的影响与si-control、MOCK相比,si-CCAT1转染组细胞活性显著下降(si-CCAT1转染786-0后在48h、72h、96h较对照组的活性均较低,存在统计学差异,P<0.001),细胞凋亡比例显著增加(P<0.001)。si-CCAT1转染Caki-1后在48h、72h、96h较对照组的活性均较低,存在统计学差异,48h处P<0.001,72h处P=0.004,96h处P =0.001),细胞凋亡比例显著增加(P<0.001)。pcDNA-CCAT1转染组细胞活性较对照组显著升高(pcDNA-CCATT1转染786-0后在48h、72h、96h较对照组的活性均较高,存在统计学差异,48h处P=0.001,72h 处P=0.001,96h 处P=0.016。pcDNA-CCAT1 转染 Caki-1后在48h、72h、96h较对照组的活性均较高,存在统计学差异,P<0.001),细胞凋亡比例均显著下降(P<0.001)。4.转染si-CCAT1或pcDNA-CCAT1对肾癌细胞系Livin蛋白表达的影响si-CCAT1可以明显引起786-0与Caki-1细胞Livin蛋白表达下调(与对照组比较,P<0.001)。pcDNA-CCAT1可以明显促进786-0与Caki-1细胞Livin蛋白表达上调(与对照组比较,P<0.001)。5.转染pcDNA-Livin可以部分逆转si-CCAT1所致的促凋亡作用(与si-CCAT1组凋亡比例比较,P<0.001),提高肾癌细胞的增殖能力(与si-CCAT1组增殖率比较,P<0.001)。si-Livin可以部分逆转pcDNA-CCAT1的促增殖作用(与pcDNA-CCAT1组增殖率比较,P<0.001),增加肾癌细胞凋亡比例(与pcDNA-CCAT1组凋亡率比较,P<0.001)。6.CCAT1与Livin蛋白结合并促进其稳定性RNA pull-down实验证实CCAT1可以富集Livin蛋白,而RNA结合蛋白免疫沉淀实验。蛋白合成抑制剂(CHX)可以抑制Livin蛋白表达水平;而蛋白酶体抑制剂(MG132)促使细胞Livin水平上调。但在CCAT1过表达的786-0肾癌细胞中,CHX处理后,Livin蛋白表达水平仍上调;MG132处理后不影响Livin的表达,结果表明CCAT1是通过防止蛋白降解的途径稳定细胞Livin水平的。7.沉默CCAT1对肾癌细胞移植瘤生长的影响在裸鼠肿瘤移植模型中,与786-OMOCκ、786-OLV-control相比,786-OLV-sh-CCAT1稳转肾癌细胞系移植瘤的生长受到明显抑制。移植瘤的体积在肿瘤移植后的第21天开始,实验组和对照组差异具有明显统计学意义(P<0.001)。接种后第35天三组荷瘤鼠肿瘤重量比较显示:注射786-OLV-sh-CCAT1组瘤块重量为0.118±0.006g,接种786-OMOCκ、786-OLV-control组瘤块重量分别为0.259±0.015g、0.261±0.013g。t检验显示实验组与对照组瘤块重量相比具有显著性差异(P<0.001)。与对照组相比,786-OLV-sh-CCA1组移植瘤内Livin蛋白表达降低明显(P<0.001)。与对照组HE染色相比,786-OLV-sh-CCAT1组可见部分细胞有变性、坏死现象:细胞排列紊乱,胞浆肿胀。与对照组相比,Livin蛋白、CD10蛋白免疫组化染色较浅,且染色的细胞数量较少。透射电子显微镜下观察见786-OLV-sO-CCAT1组瘤组织内凋亡细胞和凋亡小体较多。实验结论:1.肾癌组织及细胞系中,CCAT1可以调控肾癌细胞的增殖和凋亡,可以影响荷瘤鼠移植瘤的生长。2.肾癌组织及细胞系中,CCAT1和Livin蛋白表达较癌旁组织和细胞显著且呈正相关。CCAT1通过结合Livin蛋白稳定后者在肾癌细胞中的水平。3.肾癌组织及细胞系中,CCAT1可通过调控Livin蛋白水平的方式参与CCAT1对肾癌细胞的增殖和凋亡的调控作用。