目的:正常人在非进食情况下,食管胃连接部是处于关闭状态,这样可以保证食物由食管进入胃的单向流动,防止胃内容物逆流入食管。食管下括约肌(LES)是位于食管胃连接部的环形肌肉,其宽度约2-3cm,在防治胃食管反流的机制中起重要作用。Liebermann-Meffert等首次提出,人LES由位于胃小弯侧呈半环形的钩状纤维(clasp fibres)和位于大弯侧呈斜行分布的套索纤维(sling fibres)共同构成。这两束肌纤维与膈脚一起在食管胃结合部形成高压带,维持LES的关闭状态,使LES形成一种类似单向阀门的结构。LES的收缩和舒张功能调节机制非常复杂,包括了神经系统、体液因素及自身肌源性等多种因素。血管活性肠肽是一种由28个氨基酸组成的肽类物质, 1902年由Said首次从猪小肠分离纯化,因其明显的扩血管作用而命名为血管活性肠肽(VIP)。后来研究发现,其在循环、免疫、生殖、消化系统以及中枢、外周神经系统中都有广泛分布,所以被认为是脑肠肽的一种。近年来越来越多的研究显示,V IP在正常及肿瘤细胞的调控方面起重要作用,VIP在人体各个部位与其受体结合后,通过一系列信号传递途径发挥其生理作用。VIP受体广泛分布于人和动物的多种组织器官上。根据受体的分布及受体与配体亲和力的差异,将其分为两大类: VIP1受体和VIP2受体。VIP1受体(VIPR1)主要分布于外周组织如肺、小肠、肝、脾、胰腺、主动脉,在中枢神经系统中主要分布于中脑,而在其它脑区中分布极少。VIP2受体(VIPR2)的分布较VIP1受体更为广泛,几乎在所有的组织中都有分布,如小肠、脾、胰岛、肾、睾丸、卵巢等,但在肝脏和主动脉中没有VIP2受体的表达。中枢神经系统中广泛存在V IP2受体,如海马、垂体、松果体、脑干,因此有人认为VIP2受体应被称为神经内分泌V IP受体。目前国内外对人LES受体类型及其分型以及调节机制的研究,主要局限于胆碱能受体,对于VIP及其受体的研究则相对甚少。现有的对食管粘膜VIP及其受体的研究也主要是针对动物(猫、犬及负鼠等),与人有着种属,生理学的差异,对于人LES的VIP及其受体的表达规律及调节机制的相关研究则少之又少。本试验采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究人LES内的血管活性肠肽及其两种受体亚型在套索纤维、钩状纤维、食管环行肌和胃底环行肌中mRNA的表达规律,为进一步研究VIP及其受体在人LES调节机制中的作用奠定基础,从而更为完善的阐述人LES调节机制,为食管运动功能障碍性疾病的临床治疗提供理论依据。方法:1选取2009年5月到2010年1月在我院行手术治疗高位食管中段癌患者,术中取食管胃连接部手术标本共计30例,其中男性22例,女性8例。手术室采集新鲜标本,锐性剥去胃贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层后,制备套索纤维(S)、钩状纤维(C)、食管体部环行肌(E)和胃底环行肌(G)的肌层组织,速冻于液氮容器中,转移至-80℃冰箱保存;2按照1ml Trizol/100mg组织的比例加入Trizol,4℃条件下用组织匀浆器充分研磨组织,然后依次通过氯仿萃取,异丙醇沉淀和75%乙醇的洗涤作用最终制备出组织RNA。DEPC水溶解,经紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度和完整性之后,组织RNA进入逆转录体系,得到cDNA。应用VIP及其两个亚型VIPR1及VIPR2的引物对cDNA行扩增处理,检测其mRNA在4种肌层组织中的表达,经Gel Pro软件分析扩增产物的光密度值(IOD),并计算VIP及其受体亚型与β-actin IOD的比值表示mRNA的相对含量。结果:1.RT-PCR经紫外分光度计测定,提取的总RNA A260/A280的值是1.8-2.0;1%琼脂糖凝胶电泳显示,28S带的宽度及亮度约为18S带的两倍。2.VIP及其1型受体亚型mRNA在套索纤维、钩状纤维、食管平滑肌和胃底平滑肌各肌层均有表达;内参β-actin在250bp处亮度均匀,在各反应中,扩增结果基本一致。扩增产物的长度与预计的基本一致,分别为199bp和394bp。VIPR2在各个部位未发现表达。3. VIP在四个部位表达的数据呈偏态分布,用秩和检验,Chi-square=25.700,p=0.000,有统计学意义,因此VIP在C、S、E、G四个部位表达有差别。通过Nemenyi秩和检验两两比较得出VIP在S、E、G三个部位的表达无统计学意义,但是三个部位均与C部位对比有统计学意义。VIP在C部位平均秩次为86.93,在S部位为45.97,在E部位为59.83,在G部位为49.27。可见VIP在C部位的表达较其他部位的表达量更高,在其余部位表达量无明显差异。VIPR1在四个部位表达数据呈偏态分布,用秩和检验,Chi-square=1.540,p=0.673,无统计学意义,因此尚不能认为VIPR1在C、S、E、G四个部位表达有差别。4.另外一种受体亚型VIPR2的mRNA在四种肌条中均未发现有表达。结论:1.VIP及其1型受体亚型mRNA在套索纤维、钩状纤维、食管平滑肌和胃底平滑肌各肌层均有表达。VIPR2型受体亚型mRNA在各个部位未发现表达。2.VIP在钩状纤维的表达较其他部位的表达量更高,在其余部位表达量无明显差异。VIPR1在四种肌束表达量均无明显差异。3.VIPR2的mRNA在四种肌束中均未发现有表达。