背景 诱导分化疗法是一种治疗恶性肿瘤的新方法，其理论基础是：恶性肿瘤细胞丧失了正常分化的能力，表现为分化障碍及失控性增殖；利用分化诱导剂可以使肿瘤细胞部分或全部恢复分化潜能，转变为正常细胞或导致细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。与传统的细胞毒疗法相比，其目的不在于杀伤肿瘤细胞，因而具有较小的毒性。 早在1986年，我国学者首先应用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病，获得成功，开创了肿瘤治疗史上最为成功的先例。APL的特点是t(15，17)易位和PML/RARα融合基因，系15号染色体上的PML与17号染色体上的RARα形成PML/RARα融合基因，这是APL发病及用维甲酸治疗有效的分子基础。应用ATRA诱导分化APL细胞，完全缓解率可达85％，并发症少，无骨髓抑制，一般不会诱发DIC，ATRA现已列为APL诱导缓解治疗的首选药物。目前APL已由出血严重、预后凶险转为大部分可取得完全缓解、预后良好的白血病。 但是，近年来有多篇报道ATRA能引起较为严重的副作用，如维甲酸综合征、高组胺血症、高颅压综合症、高白细胞综合征等，若不及时诊治可以引起死亡[2]。而且，快速发生的耐药性也是ATRA治疗APL的一大缺点。ATRA诱导CR后单用ATRA维持治疗的多数患者易在短期内复发，复发后临床上往往对ATRA产生耐药，再用ATRA治疗疗效不佳；此外，少数初治的APL病例亦对ATRA不敏感。故ATRA抵抗成为临床甚为棘手的问题。尽管一些可能的机理已经被提出，但目前APL对ATRA耐药的机理仍不清楚，而且克服耐药的治疗策略仍未建立。 因此，寻找新的高效低毒分化诱导剂以及其诱导分化机制的研究已经成为国内外肿瘤基础与临床研究的重点之一。1992年，我国学者发现应用三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病，缓解率也高达65％-98％[3]，体外实验证实，PML/RARα蛋白也可能是As2O3作用的“靶分子”之一。As2O3毒副作用小，长期应用无慢性砷中毒表现，与ATRA及其他化疗药物无交叉耐药，经ATRA治疗取得缓解的急性早幼粒细胞白血病患者，复发后使用三氧化二砷治疗可获得很高疗效，As2O3是一种理想的诱导分化剂，目前已经在临床广泛使用。中药雄黄治疗白血病在传统医学中应用已有相当长的历史，其主要成分为硫化砷(As4S4)，近年，雄黄中提纯的硫化砷治疗APL已取得满意疗效。此外，羟基喜树碱(CAM)[4]、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)[5]、咐醇脂(TPA)[6]、高三尖杉酯硷(HHT)[7]、1，25(OH)2D3[8]等也被用来进行白血病诱导分化的体内外研究。淫羊藿甙(ICA)是从小蘖科草本植物朝鲜淫羊藿中提取的主要活性成分，具有多种生物化学效应，是一种新型的生物反应调节剂和诱导分化剂。前期研究已经证明其可以明显地诱导白血病细胞分化[9，10]。而对于其诱导分化的分子机制，目前的研究还不多见。 基因表达谱芯片是目前应用最为广泛的基因芯片，其将数千个特异性基因的探针或其cDNA固定在一片芯片上，对不同细胞或组织内mRNA或逆转录cDNA进行检测，从而大规模分析这些基因在不同条件下表达的差异性，利用表达谱芯片大规模、高通量和并行处理的优点，可以绘制一张反映不同条件下个相关基因表达的时空图，同时通过生物信息学方法，对各基因的表达谱进行比较和统计分析，找到发生差异表达的基因，确定不同基因在表达上的相关性，为进一步探索这些基因的功能提供线索。在白血病诱导分化方面，基因表达谱芯片的应用才刚刚起步，但在阐明其发生机制过程中，基因表达谱芯片已经显示了无可比拟的优越性，通过对白血病诱导分化基因表达谱的研究，深入了解白血病诱导分化的分子机制，有助于从基因水平上完善白血病的诱导分化治疗方案。 目的 目前肿瘤学研究的热点之一是探讨肿瘤细胞增殖与分化的调控机制，肿瘤的发生在于细胞的失控性生长，其中与生长分化有关的信号传导障碍则是增殖失控的至关重要的因素。生长因子和细胞因子作为细胞增殖的重要胞外刺激因素，与相应受体结合后，主要通过RAS/MAPK和JAK/STAT两条途径来实现信号传导[11]。丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogenactivatedproteinkinases，MAPK)作为类丝/苏氨酸蛋白激酶，是一组具有苏氨酸和酪氨酸残基的双磷酸化能力的蛋白激酶，p38/p42MAPK是其中与增殖、分化、凋亡有关的重要成员[12]；信号转导与转录激活因子家族(signaltransductorsandactivatoroftranscription，STAT)是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子，由STAT1-4、STAT5a、STAT5b、STAT6七个成员组成，STAT1和STAT3是其中的两个重要成员，通过Jak(ianuskinase)家族成员而活化，参与了对细胞增殖与分化的调控[13]。 ICA能够抑制HL-60细胞增殖，并能够诱导其分化和凋亡，本研究旨在探讨JAK/STAT与RAS/MAPK信号传导途径在ICA诱导HL-60细胞分化中的作用，研究两条途径与ICA诱导分化的相关性，寻找ICA诱导HL-60细胞分化的作用靶点，借助基因表达谱芯片这一分子生物学高新技术，进一步从分子和基因水平上研究ICA参与诱导分化的机制，为ICA的临床应用提供新的理论和实验依据。 方法 常规HL-60细胞培养，加入ICA进行诱导分化，并设不加药组为阴性对照组，加ATRA组为阳性对照组，用瑞氏染色观察细胞形态，MTT实验测定细胞增殖的变化，NBT还原实验测定细胞分化状态，RT-PCR方法检测STAT1、STAT3、p38MAPK、p42MAPK在细胞诱分前后mRNA水平上表达的变化，基因表达谱芯片检测细胞诱分前后基因表达的变化。 结果 ICA与ATRA在体外作用12h时，表现出对HL-60细胞增殖的抑制作用，24h、48h到72h，增殖抑制作用呈逐渐增大趋势，在相同的时相，ATRA的抑制作用更为明显，24h后与ICA比较，差异有显著性。24h后ICA和ATRA均表现出明显的分化诱导作用，表现为随着时间的推移，NBT阳性百分率逐渐增高，但在相同的时相，以ATRA的作用更为明显。HL-60细胞经ICA作用24h后，随着细胞增殖降低和分化的发生，在mRNA水平上，p42MAPK表达增加，STAT3表达降低，STAT1和p38MAPK未见明显的表达，在加ATRA组，p42MAPK表达增加，STAT3表达降低，p38MAPK未见明显的表达,而STAT1的表达是增加的。芯片结果显示HL-60细胞在ICA处理24h前后共有31条基因表达发生改变，其中表达上调的基因有9条，表达下调的基因有22条,参与细胞增殖、凋亡和分化的多种基因的表达水平发生了明显改变。 结论 ICA抑制HL-60细胞增殖，并能够诱导其分化，p42MAPK和STAT3与ICA诱导HL-60细胞分化有关，而p38MAPK和STAT1则与ICA诱导HL-60细胞分化无关。JAK/STAT与RAS/MAPK两条信号传导途径均参与了ICA对HL-60细胞的分化过程，p42MAPK和STAT3有可能是ICA诱导HL-60细胞分化的作用靶点，芯片结果证明各个相关基因的上调与下调可能与ICA抑制HL-60细胞增殖并诱导其分化密切相关，一些与肿瘤发生相关的差异表达基因有可能发展成为生物标记物或肿瘤早期诊断和治疗的靶点，本实验进一步从mRNA和基因水平上揭示了ICA参与白血病细胞诱导分化的机制。