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传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科，主要引起猪的肠炎和严重的腹泻，新生仔猪的感染将导致严重的的死亡，给养猪业造成了巨大的危害和经济损失。TGEV基因组为单股正链RNA，具有感染性，全长约28.5 kb，5’端20kb序列编码病毒的复制酶多聚蛋白，3’端约8.3 kb编码4种结构蛋白（S、sM、M、N）和4种非结构蛋白，这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。其中S蛋白具有重要的生物学功能：携带有主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞氨肽酶的受体识别位点，决定其宿主组织细胞亲嗜性；是决定TGEV的毒力的基因之一；具有细胞膜融合作用，协助病毒从细胞核蛋白进入细胞浆；具有血凝活性区。目前，TGEV部分基因的功能还不完全清楚，因此本文拟通过RT-PCR的方法扩增获得TGEV的全长cDNA片段，并分段克隆大片段cDNA，为后期进行感染性克隆、基因功能研究、致病机制和疫苗的开发打下坚实的基础，也为冠状病毒特别SARS等的研究提供参考。参考GenBank登陆的TGEV序列，设计了6对引物，以抽提的TGEV细胞毒总RNA为模板，分段扩增获得了TGEV-31、TGEV-32、TGEV-33、TGEV-34、TGEV-35、TGEV-36共6段PCR产物，其大小分别为1.5kb、2.0kb、1.1kb、1.4kb、1.4kb、1.3kb，扩增片段与pGM-T载体连接获得了pGMT-31、pGMT-32、pGMT-33、pGMT-34、pGMT-35、pGMT-36共6个克隆，分别克隆了1456bp、1957bp、1079bp、1362bp、142bp、1327bp的TGEV cDNA片段，经生物信息学软件拼接共获得了TGEV 3’8495bp的序列。基于TGEV S、M、sM、N、Nsp3a、Nsp3b、Nsp7的进化树分析表明，TGEV与TS、HN2002、T014、TS、PURDUE等毒株具有非常近的亲缘关系。为了获得TGEV的全长cDNA，参考NCBI登陆的TGEV病毒的序列，设计了7对引物，以抽提的TGEV细胞毒的总RNA为模板，分段扩增获得了TGEV-A、TGEV-B、TGEV-Cl（mu）、TGEV-C2（mu）、TGEV-DE、TGEV-F6片段PCR产物，其大小分别为6.2kb、5.3kb、2.3kb、3.0kb、6.9kb、5.1kb。通过点突变的方法运用，以TGEV-Cl（mu）、TGEV-C2（mu）为模版，重叠PCR法扩增出了TGEV-C片段，其大小为5.3kb。TGEV-A、TGEV-B、TGEV-C、TGEV-DE、TGEV-F五个cDNA大片段，分别与pGM-T载体连接，结果仅成功克隆了其中的TGEV-A、TGEV-B、TGEV-F三个片段，分别命名为pTA-A、pTA-B、pGM-T。为了在原核细胞和真核细胞中进行S基因主要抗原片段的表达，设计一对引物从TGEV细胞毒RNA中扩增出了包含S基因主要抗原的片段，分别连接pET32a（+）、pET28a（+）和pEGFP-Cl表达载体，获得重组质粒pET32a-S、pET28a-S、pEGFPCI-S，并在大场杆菌和Vero细胞中分别进行了原核和真核的表达，结果pET32a-S、pET28a-S在Ecoli BL21细胞中未能获得良好表达，而pEGFPCl-S在Vero细胞中成功地获得了表达。为了构建表达TGEV S基因主要抗原片段的PRV重组病毒，PCR扩增了S基因主要抗原片段，并克隆到已经构建成功的绿色荧光蛋白转移载体pPPI2．EGFP中，命名为pPPI2．EGFP．S，采用磷酸钙法将pPPI2．EGFP．S与SA215病毒基因组DNA共转染Vero细胞，结果在12小时以后可以观察到绿色荧光，24～48小时荧光到达最大量，48小时后荧光开始衰退，细胞在转染48小时后开始出现病变，96小时后细胞75％出现病变；在96小时后可以看见出现发生重组的绿色荧光病变细胞，挑取病灶反复纯化几次，获得了表达S基因主要抗原片断重组病毒PRV SA215-S，抽提病毒基因组DNA，PCR扩增能够从中扩增出大小为1.7kb的S基因主要抗原片段。应用生物信息学软件分析了PRV和TGEV全基因序列的密码子偏爱性，分别计算了其RSCU、Nc、GC、GC3s、双核苷酸组成，根据计算的结果运用GC3s-Nc分布图、GC12-GC3s散点图、对应分析解析了TGEV和PRV密码子用法发生偏爱的主要影响因素，结果表明，PRV主要偏爱于使用以G和C结尾的密码子，而TGEV则主要使用以A和U结尾的密码子，影响PRV密码子偏爱G、C的主要因素是碱基组成限制、碱基突变、翻译选择和基因功能，TGEV的影响因素则只有碱基组成限制、碱基突变，翻译选择对其密码子的用法无影响。