论文部分内容阅读
miRNA-146a是最早发现的与骨性关节炎相关的差异性miRNA。我们通过miRNA芯片技术研究发现其在急性压力损伤后的软骨细胞中表达也会上调。然而miRNA-146a在软骨细胞压力损伤中的作用尚不清楚。本研究的目的就是希望找到miRNA-146a的靶基因，并阐明其在软骨细胞压力损伤中的作用机制。miRNA芯片技术研究显示，相对于正常软骨细胞，压力损伤后的软骨细胞miRNA-146a表达上调，采用关联分析的方法，发现生物信息学分析预测的miRNA-146a的靶基因SMAD4，在联合应用的全基因组基因芯片结果中低表达。因此，我们推测miRNA-146a通过SMAD4介导的方式来调控软骨细胞的压力损伤。研究目的：在这一假设的基础上，本实验拟通过研究阐明miRNA-146a在软骨细胞压力损伤中的调控作用及其分子机制；证明SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因，并参与介导miRNA-146a对软骨细胞压力损伤的调控。我们希望此研究可以为临床上急性关节损伤的治疗带来新的研究思路和切入点。研究方法：1.原代分离及培养人软骨细胞和骨性关节炎细胞，使用光镜下观察其生长情况，MTT法绘制生长曲线，采用甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组化染色等方法对比两种细胞的差别。2.研制一套具有自主知识产权的实用多功能细胞压力加载系统，为进行细胞力学相关实验奠定基础。使用该系统构建软骨细胞压力损伤模型，力求尽量模拟高能损伤的力学特点。3.联合应用miRNA芯片和全基因组基因芯片筛选正常及压力损伤后软骨细胞的差异miRNA和基因。采用Realtime RT-PCR分析的方法，验证压力损伤组特异性高表达的miRNA-146a表达情况是否与芯片结果一致，采用Realtime RT-PCR的方法及Western Blot的方法，验证芯片结果中SMAD4和VEGF的差异表达。4.通过向细胞内转染miRNA-146a的模拟物、抑制物、无关序列和空白对照组的方式，调控miRNA-146a的表达，进一步研究其功能。5.观察调控miRNA-146a的表达后，对软骨细胞生物学特性的影响，并使用实时定量RT-PCR和Western-blot检测各组中SMAD4和VEGF的表达情况。6.观察miRNA-146a的上调和下调后对软骨细胞压力损伤作用的影响7.采用双荧光素酶报告基因系统证明SMAD4的mRNA3’UTR和miRNA-146a之间可以直接结合，验证了SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因。研究结果：1.通过细胞表型和生物学活性的检测，保证原代培养所得细胞为状态良好的软骨细胞，可以进行下一步实验。2.根据对比MTT等试验结果，选择对细胞生物学特性影响加大，且大部分存活的参数，10Mpa60min作为成模参数。3. miRNA-146a是芯片结果中差异最显著的一个，联合基因芯片结果并根据生物信息学方法预测其靶基因，找出了在芯片结果中与预测结果相一致的潜在靶基因SMAD4，并成功验证了芯片结果。4.转染外源性miRNA-146a mimics后，人正常软骨细胞中miRNA-146a的表达水平显著上升。转染外源性miRNA-146a inhibitor后，人正常软骨细胞中miRNA-146a的表达水平显著下调。5.在正常人软骨细胞中上调miRNA-146a的表达，可以使SMAD4的表达下调并使VEGF的表达上调，miRNA-146a的表达下调时可引起相反的作用。6.实验结果显示miRNA-146a具有抑制细胞增殖，促进压力损伤软骨细胞的凋亡的能力。7. SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因。研究结论：1.软骨细胞压力损伤后，miRNA-146a的表达升高，SMAD4表达下调而VEGF的表达升高。2. SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因。3. miRNA-146a可以通过SMAD4介导的方式调控VEGF的表达，具有促进软骨细胞凋亡的作用。4. miRNA-146a可能通过下调SMAD4的方式阻断TGF-β通路，上调VEGF的表达水平，促进骨性关节炎的发生。