研究背景鲍曼不动杆菌普遍存在于自然环境中,极易存活于土壤、水及动物体内,是人类皮肤、口咽部常见的定植菌,是医院感染的重要致病菌,与患者发病率、死亡率及医疗费用增加密切相关。在非发酵革兰阴性杆菌中分离率仅次于铜绿假单胞菌。该菌在多家医院引起了暴发流行,具有超强的耐药率,成为医院决定性的耐药菌,且可以在医院环境中长期存活。易感人群主要为医院ICU病房危重患者,尤其是机械辅助通气患者、创伤或者烧伤患者,感染部位主要为呼吸道、尿道、血液、创伤及烧伤的伤口等,表现为呼吸机相关性肺炎、尿路感染、菌血症、手术部位感染、皮肤和软组织感染及脑膜炎等。此外,鲍曼不动杆菌引起的社区获得性感染也有相关报道。最早报道的社区获得性鲍曼不动杆菌呼吸道感染,是在1977年于两名酒瘾患者中发现,1981年又在三名铸造厂工人中发现,然后在最近15年关于社区获得性鲍曼不动杆菌感染的报道相继出现。越来越多人认为鲍曼不动杆菌是社区获得性肺炎不常见但又至关重要的病因。大部分感染主要发生在温暖且潮湿的环境。目前治疗鲍曼不动杆菌感染的常用抗菌药物有：舒巴坦及含舒巴坦的β-内酰胺类抗生素的复合制剂(如头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦)、碳青霉烯类抗生素(尤其是美罗培南、亚胺培南)、多黏菌素类抗生素(分为多黏菌素B及多黏菌素E)、替加环素、四环素类抗生素(如米诺环素、多西环素)、氨基糖苷类抗生素(如阿米卡星、异帕米星)以及其他对鲍曼不动杆菌尚有抗菌活性的喹诺酮类抗菌药物(如莫西沙星、环丙沙星)等。近年来,随着广谱抗生素在临床的广泛应用,鲍曼不动杆菌的耐药率逐年升高,多重耐药甚至泛耐药鲍曼不动杆菌的临床分离率明显增高。泛耐药鲍曼不动杆菌(Extensively Drug-resistant Acinetobacter baumannii,XDRAB)是指对目前推荐用于治疗鲍曼不动杆菌感染的抗菌药物均耐药(包括抗阴性菌的青霉素头孢菌素、碳青霉烯类、单环类、喹诺酮类、氨基糖苷类及四环素类抗生素等)多粘菌素和替加环素除外。根据CHINET报道鲍曼不动杆菌泛耐药菌株检出率显示：2009年为17.0%,2010年为21.4%,2011年21.7%,呈逐年上升趋势。泛耐药鲍曼不动杆菌迄今为止如何治疗仍是一个全球性难题。其中一种方法为研发新药,但研发一种新的抗菌药物的周期往往需要10年左右时间,因此新抗菌药物的研发远远跟不上细菌耐药产生的速度。针对这种状况,医师往往根据经验进行抗菌药物的联合用药或者加大剂量来达到控制耐药菌感染的目的。目前常采用的两药联合方案有：①以舒巴坦或含舒巴坦的复合制剂为基础联合米诺环素(或多西环素)、碳青霉烯类抗生素或者氨基糖苷类抗生素等；②以多黏菌素E为基础联合含舒巴坦的复合制剂(或舒巴坦)、碳青霉烯类抗生素；③以替加环素为基础联合含舒巴坦的复合制剂(或舒巴坦)、碳青霉烯类抗生素、多黏菌素E等。三药联合方案有：含舒巴坦的复合制剂(或舒巴坦)十多西环素+碳青霉烯类抗生素、亚胺培南+利福平+多黏菌素或妥布霉素等。但对2种及以上抗菌药物的联合应用效果如何,目前缺乏药敏的依据支持,而且经验认为2种效果可以累加药物的联合药敏结果有时却未必支持。因此,本课题拟根据临床用药原则、用药经验以及药物抗菌活性,对南方医院2012年2月份至8月份之间临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌菌株,通过体外联合药敏实验,探讨联合用药对这些泛耐药鲍曼不动杆菌菌株的抗菌效应,从而为临床治疗提供联合用药依据,解决临床急需的对泛耐鲍曼不动杆菌的联合用药选择。由于国内目前尚无米诺环素针剂,而使用口服片剂或者多西环素针剂与其他抗菌药物联合治疗鲍曼不动杆菌的感染。因此本研究主要采用以下两药联合方案进行联合药敏实验,探讨联合用药对泛耐药鲍曼不动杆菌菌株的抗菌效应：①以舒巴坦或含舒巴坦的复合制剂为基础联合多西环素、碳青霉烯类抗生素；②以碳青霉烯类抗生素为基础联合舒巴坦或含舒巴坦的复合制剂、多西环素、喹诺酮类抗生素；③以替加环素为基础联合含舒巴坦的复合制剂(或舒巴坦)、碳青霉烯类抗生素、喹诺酮类抗生素。研究方法1、菌株的鉴定及收集：从神经外科、外科ICU、创伤骨科等患者的体液标本中临床分离出泛耐药鲍曼不动杆菌菌株(即除了对多粘菌素敏感外,对青霉素类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、碳青霉烯类、氯霉素和利福平均耐药的菌株),这些菌株采用BD-100(凤凰-100,Becton Dickinson Co., Sparks, MD,USA)全自动微生物分析仪鉴定确认。以大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853做为质控菌株,由广州市南方医院临床微生物室提供。所有鉴定收集的菌株储存在-80℃冰箱备用。2、培养基的配制：CLSI (the Clinical and Laboratory Standards Institute,临床和实验室标准化研究所,以前称为NCCSL)推荐使用CAMHB(校正阳离子的MH肉汤)。将MH肉汤培养基粉剂按21g加入1000ml蒸馏水配制成MH肉汤,小量分装后进行高压灭菌。每次试验均使用新鲜配制的灭菌MH肉汤。3、抗菌药物贮存液的制备：除了替加环素购自美国惠氏公司外,其他抗菌药物(包括美罗培南、多西环素、舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星)均购自中国食品药品监督管理局(CFDA)。抗菌药物贮存液浓度不应低于10OOμg/m1(如1000μg/m)或远远大于CLSI标准中抗菌药物的R(耐药)值。配制各种抗菌药物原液的溶剂一般为蒸馏水、磷酸盐缓冲液或乙醇等,稀释剂多为蒸馏水。本次试验所使用的抗菌药物均以灭菌蒸馏水为溶剂,配制成最终浓度为2048μg/ml或1280μg/ml的贮备液。最后配置好的贮备液放置在-80℃冰箱保存备用。4、接种菌悬液的配制：将预先冻存的菌株放入预先配制好的灭菌MH肉汤管中,在35℃的培养箱中培养过夜复苏。然后将复苏后的菌株在血平板上进行接种,在35℃的培养箱中培养过夜,分离出单个菌落。然后挑取单个菌落进行再次培养。在已分纯并过夜新鲜培养的的细菌平板上挑取4～5个形态相同的菌落接种于MH肉汤中增菌6h(此时为对数生长期)。菌落用3～5ml无菌生理盐水中经比浊仪调整浓度至0.5麦氏单位(约为1×108CFU/ml),再用灭菌MH肉汤进行稀释至所需的浓度,即为接种菌悬液。5、微量肉汤稀释法：依照CLSI(2009年版)推荐的方法进行微量肉汤稀释法测定每种抗菌药物对泛耐鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)值。根据2005年美国食品药品管理局(FDA,the United States Food and Drug Administration)的规定,替加环素所使用的折点为≤2μg/ml(替加环素2005,替加环素说明书,惠氏制药有限公司)。其他抗菌药物按照CLSI2009规定的折点判定。通过在96孔板上进行棋盘设计法实验来测定两种药物间的联合效应。所稀释的药物浓度范围包含该抗菌药物的MIC值。将抗菌药物贮备液以灭菌的MH肉汤倍比稀释成1024、512、256、128、64、32、16…0.25μg/ml等系列浓度。将配好的不同浓度的两种抗菌药物按棋盘法设计两两组合加入96孔平板中,每种药物各50μl,再加入配制好的细菌悬液100μl,35℃培养20h。同时,每次药敏试验必须使用大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株,只有当两者的MIC值界于标准参考值范围时,方认为试验操作准确可靠且同时对照的试验菌株生长良好,方可认为试验成功,结果可接受。两种药物间的相互作用通过分级抑菌浓度指数(FICI,the Fractional Inhibitory Concentration Index)进行判定。读取结果并记录单独用药时的最低抑菌浓度(MIC甲药单用和MIC乙药单用),并选择最佳组合效应时两药联用时各自的MIC值(MIC甲药联用和MIC乙药联用),以计算分级抑菌浓度指数,即FICI=MIC甲药联用/MIC+MIC乙药联用/MIC乙药单用。判读标准：FIC指数≤0.5为协同作用,0.5<FICI≤1为相加作用,1<FICI≤2为无关作用,FICI>2为拮抗作用。6、统计学分析：所有数据经统计学分析软件SPSS13.0进行处理。各组药物之间的抗菌效应比较采用多个独立样本非参数检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.舒巴坦或者头孢哌酮/舒巴坦联合其他抗菌药物对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌效应如下：1.1舒巴坦或者头孢哌酮舒巴坦与美罗培南、多西环素联合后,各自的MIC50及MIC90均较单用时下降。与美罗培南联合,舒巴坦或者头孢哌酮/舒巴坦的MIC50均可降为单用时的1/2；与多西环素联合,舒巴坦的MIC50及MIC90均可降为单用时的1/4,头孢哌酮/舒巴坦的MIC50及MIC90则降为单用时的1/2；美罗培南或者多西环素的MIC50及MIC90也均较单用时下降。1.2舒巴坦或者头孢哌酮/舒巴坦联合美罗培南、多西环素后,浓度-累积抑菌百分率曲线均出现左移；尤其是与美罗培南联合后,浓度-累积抑菌百分率曲线发生了明显左移,对泛耐药鲍曼不动杆菌表现出良好的体外抗菌活性。1.3舒巴坦单用时MIC主要分布在32μg/ml与64μg/ml两个浓度点,美罗培南则主要分布在64μg/ml两者联合后,舒巴坦的MIC则主要分布在16μg/ml与8μg/ml两个浓度点,美罗培南的MIC分布主要集中在16μg/ml,其次为32μg/ml,两者的MIC值分布均比单用时明显左移。相似地,头孢哌酮/舒巴坦单用时的MIC主要集中在64μg/ml与128μg/ml,与美罗培南联合后则主要集中在32μg/ml与16μg/ml；美罗培南的MIC分布也由单用时的64μg/ml转变为16μg/ml与32μg/ml1.4舒巴坦与多西环素联合后,舒巴坦的MIC值主要分布在16μg/ml与32μg/ml多西环素则由单用时的64μg/ml转变为分散在64μg/ml与64μg/ml这三个浓度点。头孢哌酮/舒巴坦联合多西环素后,由单用时的64μg/ml与128μg/ml转变为32μg/ml与64μg/ml,多西环素则由单用时的64μg/ml转变为32μg/ml。舒巴坦或者头孢哌酮/舒巴坦联合多西环素后,各自的MIC值分布稍有左移,但与联合美罗培南相比,左移不明显。1.5舒巴坦或者头孢哌酮/舒巴坦联合美罗培南均主要表现为协同和相加作用,协同作用分别占26%(13株)和10%(5株),相加作用分别占74%(37株)和99%(45株),均未表现出无关和拮抗作用。而舒巴坦或者头孢哌酮/舒巴坦与多西环素联合分别有66%(33株)和72%(36株)表现为相加作用,但有一部分表现为无关作用,分别占22%(11株)和26%(13株),同时分别有小部分为协同作用(12%,2%),未表现出拮抗作用。1.6经统计学分析,四组抗菌药物对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外联合抗菌效应具有统计学差异,X2=29.431,P=0.000。根据平均秩次进一步推断,舒巴坦联合美罗培南的抗菌效应最好(平均秩次为78.12),其次为头孢哌酮/舒巴坦联合美罗培南的抗菌效应(平均秩次为92.20),再者为舒巴坦联合多西环素(平均秩次为109.69),最后为头孢哌酮/舒巴坦联合多西环素(平均秩次为121.99)。2.美罗培南联合不同药物对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌效应如下：2.1美罗培南与多西环素联用后,两者的MIC50及MIC50均显著下降,体外抗菌活性明显提高,FIC指数分布为：FICI≤0.5占38%(19株),0.5<FICI≤1占62%(31株),1<FICI≤2为0,FICI>2为0。联合用药后,浓度-累积抑菌百分率曲线明显左移,美罗培南的MIC50及MIC90均下降为单用时的1/4,多西环素的MIC50及MIC9o分别降为单用时的1/2和1/4。两者单用时的MIC值分布都主要集中在64μg/ml,联合后,美罗培南的MIC值分布主要集中在16μg/ml,多西环素的MIC主要集中在16μg/ml与32μg/ml两个浓度点,较单用时均出现明显左移。2.2美罗培南与环丙沙星联用后,两者的MIC50下降均不明显,FIC指数分布为：FICI≤0.5为0,0.5<FICI≤1占56%(28株),1<FICI≤2为44%(22株),FIC>2为0。联合后浓度-累积抑菌百分率曲线左移不明显,美罗培南的MIC50及MIC90均仅下降为单用时的1/2,而环丙沙星的MIC50及MIC90却均未较单用时下降。两者的MIC分布趋势也无明显左移。美罗培南联用后的MIC主要集中在64μg/ml与32μg/ml两个浓度点,与单用时的64μg/ml无明显变化。环丙沙星单用时的MIC主要为32μg/ml,其次为64μg/ml,联用后其MIC值主要集中在32μg/ml与16木g/ml这两个浓度点,变化不大。2.3美罗培南与舒巴坦联用后,其MIC50明显下降,表现出良好的体外抗菌活性,FIC指数分布为：FICI≤0.5为26%(13株),0.5<FICI≤1占74%(37株),1<FICI<＝2为0,FICI>2为O。美罗培南联合舒巴坦后,浓度-累积抑菌百分率曲线明显左移。美罗培南的MIC50及MIC90均可下降为单用时的1/4,舒巴坦MIC50及MIC90分别下降为单用时的1/2和1/4。联合后,美罗培南的MIC分布主要集中在16μg/ml其次为32μg/ml,舒巴坦单用时MIC主要分布在32μg/ml与64μg/ml两个浓度点,联合后主要集中在16μg/ml与8μg/ml,两者的MIC分布均比单用时明显左移。2.4美罗培南与头孢哌酮/舒巴坦联用后,其MIC50有所下降,FIC指数分布为：FICI≤0.5为10%(5株),0.5<FICI<≤1占90%(45株),1<FICI≤2为0,FICI>2为O。美罗培南联合头孢哌酮/舒巴坦后,各自的MIC50及MIC90均下降为单用时的1/2,浓度-累积抑菌百分率曲线也有所左移。联合后,美罗培南的MIC主要集中在16μg/ml与32μg/ml两个浓度点,头孢哌酮/舒巴坦单用时的MIC主要集中在64μg/ml与128μg/ml,联合后则主要集中在32μg/ml,其次是16μg/ml。2.5经统计学分析,四组联合药物之间对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性具有统计学差异,X2=65.551,P=0.000,根据平均秩次进一步推断,以美罗培南+多西环素的联合效应最好(平均秩次为74.18),其次为美罗培南+舒巴坦(平均秩次为84.86),再者为美罗培南+头孢哌酮/舒巴坦(平均秩次为99.10),最后为美罗培南+环丙沙星的联合抗菌效应(平均秩次为143.86)。3.替加环素单用及联合其他抗菌药物对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌效应如下：3.1替加环素对泛耐药鲍曼不动杆菌的抗菌活性要优于其他抗菌药物。40株泛耐药鲍曼不动杆菌对替加环素均表现敏感,对美罗培南、环丙沙星、舒巴坦及头孢哌酮/舒巴坦均耐药。替加环素MIC值范围在0.-2μg/ml-2μg/ml之间,MIC50为1μg/ml,MIC90为2μg/ml；而美罗培南的MIC50及MIC90均为128μg/ml,环丙沙星和舒巴坦的MIC50及MIC90相同,均分别为64μg/ml和256μg/ml,头孢哌酮/舒巴坦的MIC50及MIC90则均为256μg/ml。3.2替加环素与不同抗菌药物联合对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌效应如下：3.2.1替加环素联合美罗培南的体外抗菌效应：主要表现为协同作用和相加作用(5株,12.5%和31株,77.5%),无关作用有4株(10%),未表现出拮抗作用。3.2.2替加环素联合环丙沙星的体外抗菌效应：主要表现为无关作用(32株,80%),有部分表现为相加作用(8株,20%),没有协同作用及拮抗作用。3.2.3替加环素联合舒巴坦的体外抗菌效应：主要表现为相加作用(29株,72.5%),表现为协同作用的有2株(5%),无关作用有9株(22.5%),未表现出拮抗作用。3.2.4替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦的体外抗菌效应：主要表现为相加作用(30株,75%),无关作用有10株(25%),没有协同作用及拮抗作用。3.2.5替加环素联合美罗培南、舒巴坦及头孢哌酮/舒巴坦后,浓度-累积抑菌百分率曲线均出现明显的左移,表明替加环素与这三种抗菌药物联合均以相加作用为主；而替加环素与环丙沙星联合后,浓度-累积抑菌百分率曲线无明显变化。3.2.6抗菌药物单用时,替加环素的MIC值呈单峰分布,主要集中在0.5μg/ml美罗培南的MIC值主要集中在128μg/ml。两者联合后,分布峰值均较前减小,替加环素的MIC值主要集中在0.25μg/ml,美罗培南的MIC值则集中在32μg/tnl。但是替加环素与环丙沙星联合后,两者的MIC分布峰值并无相似变化。替加环素与舒巴坦联合后则表现为双峰分布,替加环素的MIC分布峰值由0.5μg/ml转变为0.25μg/ml和0.5μg/ml舒巴坦的MIC分布峰值则由64μg/ml转变为32μg/ml和64μg/ml。而替加环素与头孢哌酮/舒巴坦联合后主要是头孢哌酮/舒巴坦的MIC分布峰值由256μg/ml转变为128μg/ml,替加环素的MIC分布峰值变化不大。3.3经统计学分析,四种抗菌药物组合之间对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌效应具有统计学差异,X2=51.624,P=0.000。根据平均秩次进一步推断,替加环素联合美罗培南的抗菌效应最好(平均秩次为57.59),其次为替加环素联合舒巴坦的抗菌效应(平均秩次为71.09),再者为替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦(平均秩次为75.63),最后为替加环素联合环丙沙星的抗菌效应(平均秩次为117.70)。研究结论1.舒巴坦或者含舒巴坦复方制剂与碳青霉烯类抗生素美罗培南联合对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外联合效应主要表现为协同和相加作用,没有无关和拮抗作用,具有良好的体外抗菌活性。2.美罗培南或者含舒巴坦复方制剂(包括舒巴坦)与四环素类抗生素多西环素联合,对泛耐药鲍曼不动杆菌均主要表现为相加作用,抗菌作用相互增强。尤其是美罗培南与多西环素联合,主要表现为协同和相加作用,没有无关作用和拮抗作用,对泛耐药鲍曼不动杆菌具有良好的体外抗菌活性。而美罗培南与环丙沙星联合表现出的相加作用和无关作用比例相当,对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性较差。3.替加环素对泛耐药鲍曼不动杆菌尚具有较高的敏感性,对泛耐药鲍曼不动杆菌具有良好的体外抗菌活性。4.替加环素与美罗培南、舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦的联合抗菌效应均以相加作用为主,其中与美罗培南、舒巴坦的联合效应具有部分协同作用,对泛耐药鲍曼不动杆菌具有良好的体外抗菌活性。综上所述,在当前多重耐药菌严峻的形势下,美罗培南联合多西环素或舒巴坦复方制剂(含舒巴坦),舒巴坦复方制剂(含舒巴坦)联合多西环素,替加环素单用或者联合美罗培南、舒巴坦对泛耐药鲍曼不动杆菌均具有良好的体外抗菌活性,为临床治疗泛耐药鲍曼不动杆菌的感染提供重要的参考,可作为对泛耐药鲍曼不动杆菌感染的有限治疗手段的补充。