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背景和目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染已成为全球性公共卫生问题,据估计全球约有2.1亿HCV感染者,其中85%发展成为慢性丙型肝炎。现有的抗HCV治疗方案十分有限且迄今尚无有效的疫苗问世。HCV有效的免疫逃逸策略是HCV持续感染及疫苗研究困难的关键问题,但免疫逃逸的机制尚不清楚。研究表明,病毒适应环境的高度可变性的发生机制而非宿主免疫防御功能的缺陷或损伤,可能在病毒免疫逃逸中起更重要的作用。HCV具有明显的异质性,以一群不同但密切相关的变异株即准种(quasispecies, QS)存在于感染者体内。研究表明准种具有两个显著特性,其一是准种群体内变异株的分布是不均匀的,总以一种变异株为优势株即主要变异株(dominant variants);其二是是准种的优势变异株处于动态变化中,研究显示同一个体在不同的时间点准种的主要变异株是不同的,主要变异株的迁移可能反映了宿主的免疫压力及病毒的强大适应性。由此可见,动态变化的HCV准种优势株蕴藏着病毒免疫逃逸的相关信息。对动态变化的HCV准种优势株长片段序列分析,以获得序列的变异特征及进化规律,是探索HCV免疫逃逸分子基础的新途径,而建立基于HCV长序列的、准确的、动态变化的准种优势株的鉴定方法是准种优势株相关研究的重要前提。HCV包膜2基因在HCV基因组中变异程度最高,是公认的受到宿主免疫压力即正选择压力(positve selection pressure)作用最强的区域。位于宿主强烈免疫压力作用下的位点发生变异,可能引起其蛋白功能发生相应的变化,有利于新的变异株发生免疫逃逸,躲避宿主的免疫清除。如果一个氨基酸位点非同义核苷酸替代速率(dN)显著地超过其同义核苷酸替代速率(dS),那么我们称这个位点为正选择位点。目前,E2基因正选择位点的相关研究报道有限。本研究从中国人HCV感染患者系列标本库(CQueen cohort)中筛选出未抗病毒治疗的1b型HCV慢性感染者的系列血清样本,进行了6Kb的长链RT-PCR扩增及克隆,建立了基于6Kb长序列的动态变化的准种优势株的鉴定方法。同时,用固定效应似然法(fixed effects likeli- hood method, FEL)对基于6Kb长片段的E2基因的正选择位点进行了分析,初步探讨了E2基因的正选择位点分布及其与已知功能区之间的关系。材料和方法:1. HCV 5′端6Kb长链RT-PCR扩增及高效克隆:从中国人HCV感染患者系列标本库(CQueen cohort)中筛选出3例未经IFN抗病毒治疗的1b型HCV慢性感染者及其3个不同时间点共9份血清样本作为研究对象,各样本两两间隔时间为半年以上,HCV RNA≥6log10 copies/ml。根据GenBank中所有已知的HCV 1b型全基因组序列,选择相对保守、GC含量适当的区域,设计RT引物及巢式PCR扩增引物,其中正向引物与本研究小组已建立的5.2Kb扩增方法所用的正向引物相同,扩增产物长度为6, 030 bp。采用SuperScriptTMⅢRNase H–逆转录酶和Platinum高保真DNA聚合酶、优化RT及PCR条件,以期获得清晰、无杂带的6Kb的目的条带。采用高效的长片段TOPO? XL PCR克隆试剂盒进行克隆。2. HCV 6Kb扩增子动态变化的准种优势株的确定:从患者1的3份系列血清样本中各随机挑选33个阳性克隆(共99个克隆),对E2区5’端396 bp片段直接测序,采用CLUSTAL_X、BioEdit、MEGA软件序列比对后构建系统进化树,确定各时间点的准种主要变异株及主要变异株发生更替的时间间隔;从33个阳性克隆中(准种复杂程度较高的时间点)随机挑选10,15,20,25,30个克隆,各重复100次,组成5组,用χ2检验确定能准确检出准种优势株所需的最少克隆数;用第2、3例患者对上述结果进行验证。3.基于HCV 6Kb长序列的E2基因正选择位点分析及其功能意义:用HyPhy软件包(http:// www.hyphy.org/)内嵌的固定效应似然法(fixed effects likelihood method, FEL)检测各患者基于6Kb长序列的E2基因的正选择位点,将所检测到的位点与E2基因已知功能区进行比对,分析各位点的功能意义。主要结果:1.建立了HCV 5′端6Kb长链RT-PCR扩增及高效克隆的方法:通常HCV RNA定量≥6 log10 copies/ml的血清标本扩增均可获得阳性条带,目的条带亮度高,特异性好。将PCR回收产物连接于pCR?-XL-TOPO? T载体,每个LB平板上可获得200～800个转化克隆,用EcoRⅠ内切酶酶切鉴定,阳性克隆比例大于95%。2.建立了6Kb扩增子动态变化的准种优势株的鉴定方法:系谱分析显示每个患者3个时间点的准种主要变异株分别位于3个不同的进化枝;25及30个克隆的主要变异株与总体33个克隆的主要变异株的检出完全一致。3. 3例1b型HCV慢性感染者系列血清样本基于6Kb长序列的E2基因分析,共检测到5个正选择位点:通过对每例HCV慢性感染者6Kb长序列的E2基因动态变化的准种变异株的适应性进化分析,发现慢性HCV感染者体内的E2区准种复杂程度并非随着感染时间的延长而进行性增高,在某个时间点上准种变异株的序列可能会趋于一致。在患者1、3共检测到5个位点:aa 384、aa 399、aa 410、aa 475和aa 522,分布于HCV E2基因HVR1区、HVR2区及HCV E2-CD81分子结合区。主要结论:1.建立的HCV 5′端6Kb长链RT-PCR扩增及高效克隆方法,为HCV免疫逃逸的分子基础研究奠定了基础。2.每份血清样本随机挑取25个阳性克隆足以准确确定HCV慢性感染者体内的动态准种优势株。HCV感染患者体内的病毒准种优势变异株的进化速度较快,半年时间即可发生更替。3.慢性HCV感染过程中,E2基因位于重要功能区的aa位点受到了宿主强烈的免疫压力,aa 384、aa 399及aa 410位点的变异可能导致HCV发生体液免疫逃逸;而aa 475和aa 522位点的变异则可能通过影响HVR2区的功能,或改变HCV E2-CD81分子的亲和力,或改变CD81分子的结构而导致HCV发生固有免疫逃逸。该研究为分析HCV C-NS4A基因片段的正选择位点奠定了良好的基础。