研究背景:我们前期的研究表明:脊髓损伤(SCI)局部微环境中早期可检测到神经损害性的M1型巨噬细胞和神经保护性的M2型巨噬细胞,但损伤一周后M1细胞占绝对优势,而M2细胞比例则很少;采用M2细胞过继免疫可以提高损伤局部M2细胞的比例,发挥神经保护作用。但是,其机制尚不清楚。研究证实,SCI的一周前后是炎症反应最重的时间段,因此,本研究拟以SCI后7D为时间点,分析M2细胞过继回输对损伤局部基因转录表达的影响,为SCI的临床治疗提供新的理论和实验依据。目的:采用RNA-Seq技术,以SCI后7D为时间点,分析M2细胞过继回输对损伤局部基因转录表达的影响;生物信息学分析,筛选、鉴定出关键分子和信号通路。方法:(1)分离成年SD大鼠的股骨骨髓,用L929条件培养基培养出骨髓来源的巨噬细胞(即M0细胞),通过条件诱导分别得到M1和M2型巨噬细胞;(2)采用流式细胞术和免疫荧光染色法鉴定M0、M1和M2型巨噬细胞的标志;(3)RNA-Seq分析M0、M1、M2巨噬细胞在转录水平的表达(4)荧光定量PCR验证RNA-Seq结果;(5)采用纽约大学NYU重物损伤仪制备SD大鼠脊髓损伤模型,并在当天过继免疫M2型巨噬细胞;(6)SCI后7天处死各实验组SD大鼠,取出包括损伤中心在内的约1cm脊髓组织送检;(7)RNA-Seq检测SCI局部基因在转录水平的表达变化;(8)采用荧光定量PCR验证转录RNA-Seq的结果;(9)生物信息学分析,筛选、鉴定出关键分子和信号通路。结果:(1)在L929细胞条件培养基中培养的巨噬细胞表达CD68、CD45,几乎不表达Arg1和CCR7;在加入了IFN-γ和LPS的培养基中培养的巨噬细胞表达CCR7和CD68;在含有IL-4、IL-10的培养基中培养的巨噬细胞表达M2Arg1和CD68;(2)巨噬细胞转录组分析结果显示:M0与M1组相比较,总共有2535个差异基因,其中有1118个上调和1418个下调基因;M0与M2比较,总共有2129个差异基因,其中有694个上调和1436个下调基因;M1与M2比较,总共有3107个差异基因,其中有1336个上调和1772个下调基因;GO富集分析显示显著差异表达的基因集中在免疫应答,应激反应,对外界刺激的反应,炎症反应,细胞对化学刺激的反应,有丝分裂细胞周期,细胞氮复合物代谢过程,DNA代谢过程等。KEGG富集通路分析显示主要富集通路为:ECM受体相互作用、抗原加工提呈、TNF通路、p53通路、HIF-1通路、FoxO和NF-kB信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等;(3)M2细胞后用CFSE染料标记,经尾静脉注射入SCI大鼠,术后三天在SCI损伤中心及周围组织均可发现CFSE~+细胞;(4)M2巨噬细胞过继免疫转录组分析结果发现:与假手术组比较,M2巨噬细胞过继免疫组总共有12个差异基因,其中有5个上调和7个下调基因;SCI后7d与假手术组相比,总共有4304个差异基因,其中有2321个上调和1984个下调基因;M2细胞过继免疫组与假手术组相比,总共有2986个差异基因,其中有1824个上调和1163个下调基因;SCI损伤组与M2巨噬细胞过继免疫组相比,总共有41个差异基因,其中有31个上调和10个下调基因。GO富集分析显示显著差异表达的基因集中在ncRNA代谢过程、rRNA代谢过程、核糖核蛋白复合过程、核糖体、CCR2趋化因子受体结合过程等;KEGG富集通路分析显示主要富集的通路为:TNF、内质网蛋白加工、PI3K-Akt、NOD样受体、抗原加工和递呈等信号通路。结论:1.成功培养和诱导出M0、M1和M2各型巨噬细胞,细胞的纯度符合后续实验要求;2.M0、M1和M2的RNA-Seq结果显示:M0与M1组相比较,总共有2535个差异基因,其中有1118个上调基因和1418个下调基因;M0与M2比较,总共有2129个差异基因,其中有694个上调基因和1436个下调基因;M1与M2比较,总共有3107个差异基因,其中有1336个上调基因和1772个下调基因;ECM受体相互作用、抗原加工提呈、TNF通路、p53通路、HIF-1通路、FoxO和NF-kB信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等是典型富集的信号通路;3.经尾静脉注射过继免疫SCI大鼠后,M2型巨噬细胞可以浸润到损伤的脊髓;4.M2巨噬细胞过继免疫的RNA-Seq结果显示:SCI损伤组与M2巨噬细胞过继免疫组相比,总共有41个差异基因,其中有31个上调和10个下调基因;TNF、内质网蛋白加工、PI3K-Akt、NOD样受体、抗原加工和递呈等信号通路是典型富集的信号通路。