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目的研究经慢病毒介导,大鼠睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)对SD大鼠视神经钳夹伤(Optic nerve crush,ONC)模型视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGCs)的保护作用。方法1、CNTF-BMSCs的体外构建：全基因合成含信号肽的大鼠CNTF基因编码序列并克隆至pHIV-dTomato慢病毒载体质粒,构建重组质粒CNTF-dTomato. CNTF-dTomato/pHIV-dTomato与慢病毒辅助质粒psPAX2及pMD2G共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得重组慢病毒CNTF-lenti及control-lenti.以CNTF-lenti/control-lenti感染SD大鼠BMSCs,构建CNTF-BMSCs及空载-BMSCs细胞,根据红色荧光蛋白dTomato表达情况确定病毒感染效率；未感染lenti的BMSCs为空白-BMSCs.ELISA法测定空白-BMSCs、空载-BMSCs及CNTF-BMSCs细胞培养液中CNTF的质量浓度。将CNTF-BMSCs向成骨和成脂方向诱导分化,以茜素红染色和油红-O染色对分化细胞进行鉴定。2、ONC大鼠模型建立及实验动物分组：60只成年雄性SD大鼠随机分为空白对照组(A组)、手术对照组(B组)、PBS治疗组(C组)、空白-BMSCs治疗组(D组)、空载-BMSCs治疗组(E组)和CNTF-BMSCs治疗组(F组),每组各10只；B～F组均双眼建立ONC模型,夹伤后立即向C-F组大鼠玻璃体腔内注射相应液体各10μL。3、玻璃体腔注射CNTF-BMSCs对ONC作用的观察：损伤后第14d处死各组大鼠,摘除双眼眼球。石蜡切片HE染色法观察大鼠视网膜形态变化,计数视网膜节细层细胞数。免疫荧光染色检测CNTF蛋白在视网膜的定位和表达情况。Westernblot法检测视网膜内Caspase-3和Brn3a蛋白的表达,照片扫描后采用Image J软件处理,计算各蛋白相对表达率。结果1、CNTF-BMSCs构建成功：质粒测序结果显示CNTF-dTomato质粒构建成功。重组慢病毒对BMSCs的感染率达95%。ELISA检测结果显示,感染后第1、2、3、7d,CNTF-BMSCs组细胞上清液中CNTF蛋白的质量浓度明显高于空白-BMSCs组及空载-BMSCs组,差异均有统计学意义(P均=0.000):CNTF-BMSCs组感染后2、3、7d细胞上清液中CNTF质量浓度均明显高于感染后1d,差异均有统计学意义(P=0.013,0.004,0.042)。CNTF-BMSCs经成脂培养基诱导后分化的细胞油红-O染色呈红色染色,经成骨培养基诱导后分化的细胞茜素红染色可见橘红染色。2、成功建立ONC大鼠模型：HE染色结果显示,夹伤后14dB组、C组大鼠视网膜RGCs大量丢失,空泡化严重,细胞排列紊乱,显示ONC模型成功建立。D、E、F组大鼠视网膜RGCs空泡化减轻,细胞排列较整齐。3、CNTF-BMSCs对RGCs的保护作用：节细胞层细胞计数结果显示,夹伤后14dB组、C组大鼠节细胞层细胞数较A组大幅减少,D、E、F组大鼠节细胞层细胞数高于B、C二组(P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,夹伤后14dA组大鼠视网膜各层均无CNTF表达,F组视网膜节细胞层CNTF大量表达,其他各组视网膜节细胞层见少量CNTF表达。Western blot图片处理结果显示,夹伤后14dF组活性Caspase-3相对表达率低于其他各组(P均=0.000)；Bm3a相对表达率低于A组,高于其他各组(P均<0.05)。结论利用慢病毒载体可成功构建稳定过表达分泌型CNTF蛋白的大鼠BMSCs。玻璃体腔内注射CNTF-BMSCs可有效减少大鼠视神经钳夹伤后RGCs的丢失,对RGCs具有明显的保护作用。