目的:大肠癌(CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。近年来,已研究出多种治疗CRC的方法,从而显著提高了CRC患者的总体生存率。尽管如此,仍有50%的CRC患者发生疾病的复发。因此,迫切需要揭示CRC发生和发展的潜在分子机制,以探寻新的治疗靶标。Wnt/β-catenin通路中β-catenin不能被GSK3β磷酸化。非磷酸化的β-catenin不能被蛋白酶体降解,从而导致β-catenin在胞浆内积聚,并移向核内。进而激活其下游靶基因c-Myc表达,c-Myc与肿瘤细胞增殖密切相关。RNF8(Ring Finger Protein 8)是具有RING结构域的泛素E3连接酶,在DNA损伤应答和细胞周期调控中起着至关重要的作用。有文献报道指出RNF8通过激活Wnt/β-catenin途径或增强Twist和雌激素受体α(ERα)的活性在乳腺癌中高表达,并与乳腺癌的进展呈正相关。这些发现暗示了RNF8在癌症进展中的重要作用。但是,RNF8在调节CRC进展中的确切功能和机制仍然未知。在这项研究中,我们发现结肠癌组织中RNF8和c-Myc之间存在正相关。随后,我们发现RNF8通过与β-catenin结合并通过将K63多聚泛素缀合到其上来促进β-catenin核易位,从而上调c-Myc表达。此外,RNF8的敲低显著抑制体外和体内结肠癌细胞的生长。这些结果表明RNF8通过上调β-catenin介导的c-Myc表达来促进结肠癌的增殖,并为结肠癌进展的机制提供了新的见解。方法:第一部分:RNF8和c-Myc在结肠癌中的表达及与结肠癌患者预后相关性的分析研究:(1)利用TCGA数据库中的结肠癌RNA-seq的数据,检测了478例结直肠癌患者及41例正常对照组患者的组织样品中RNF8和MYC的mRNA水平。(2)通过免疫组织化学染色检测了结肠癌组织中RNF8和c-Myc蛋白表达与癌旁良性组织之间的差异。第二部分:RNF8调节结肠癌细胞功能及机制研究:(1)设计RNF8的siRNA,通过Realtime PCR检测RNF8对MYC转录水平影响;设计RNF8的过表达质粒和shRNA,并在结肠癌细胞系HCT116和SW480中检测表达效率;随后利用Western blot方法检测结肠癌细胞系HCT116和SW480中RNF8和c-Myc、β-catenin的蛋白水平以反映RNF8的外源过表达及内源性敲除对二者的影响。(2)利用免疫共沉淀实验,检测RNF8与β-catenin之间是否存在相互作用。在HCT116和SW480细胞中过表达和沉默RNF8,探讨是否能够影响β-catenin在细胞核内分布。(3)在HCT116和SW480细胞中过表达RNF8和泛素,然后通过泛素化检测法检测到β-catenin的泛素化。(4)获取RNF8干扰序列基因片段,进行慢病毒载体的重组质粒构建,然后进行慢病毒包装及滴度的检测,利用慢病毒转染结肠癌细胞系HCT116和SW480,构建了稳定沉默RNF8的HCT116和SW480细胞系,并用这些细胞进行克隆形成实验及CCK8增殖测定实验。结果:第一部分:(1)首先我们根据TCGA数据库分析了478名结肠癌患者和41名正常对照组患者组织样本中RNF8与癌基因MYC的表达。结果表明,与正常对照组相比,结肠癌组织中RNF8和MYC的mRNA水平升高。并且二者的m RNA水平在结肠癌组织中呈正相关,这表明结肠癌中RNF8可能与MYC存在特定的关系。(2)在包含99例癌组织和78例癌旁良性对照组织的结肠癌组织微阵列芯片中进行了RNF8和c-Myc的免疫组织化学染色。与TCGA数据一致,结肠癌组织中RNF8和MYC基因的蛋白水平均显著高于良性对照组织中的蛋白水平,并且在结肠癌组织中RNF8的表达与c-Myc的表达呈正相关。并且与结肠癌病例中c-Myc高表达相似,RNF8高表达患者的总生存期较差。提示RNF8与c-Myc在结肠癌患者预后不良中存在潜在关系。第二部分:(1)RNF8通过β-catenin上调c-Myc表达:与阴性对照NC组相比,siRNF8的mRNA水平明显降低;并且当敲减RNF8后,MYC的m RNA水平明显降低。这提示我们,RNF8能够上调MYC的转录。当RNF8蛋白表达量增加时,c-Myc蛋白表达量也增加;其次,我们发现当稳定沉默RNF8后,c-Myc的蛋白表达量与正常对照组相比也相应减少。上述结果进一步提示我们RNF8可能上调c-Myc的表达。接下来我们同时在HCT116和SW480细胞中过表达RNF8和沉默β-catenin,并检测c-Myc的表达水平。结果表明,当HCT116和SW480细胞中的β-catenin沉默时,RNF8过表达对c-Myc表达的诱导作用大大降低。这些结果表明RNF8依赖于β-catenin的c-Myc的表达。(2)RNF8促进β-catenin的核异位。我们分别在HCT116及SW480细胞中进行了RNF8和β-catenin之间的免疫共沉淀。发现二者之间是存在相互作用的。接下来,我们在HCT116和SW480细胞中进行核提取,结果显示RNF8的过表达或沉默会提高或降低核组分中β-catenin的蛋白水平。(3)RNF8促进β-catenin的K63多聚泛素化。我们在HCT116和SW480细胞中过表达RNF8和泛素,然后通过泛素化检测法检测到β-catenin的泛素化。进一步分析其泛素类型,发现RNF8通过K63连接的多聚泛素化促进β-catenin在结肠癌细胞中的核易位。(4)我们构建了含有shRNA慢病毒感染的稳定沉默RNF8的HCT116和SW480细胞系进行克隆形成实验及CCK8增殖测定实验。发现RNF8缺失会导致结肠癌增殖能力减弱。结论:1.RNF8在结肠癌中的表达增加,并与c-Myc呈正相关;2.RNF8通过β-catenin调控c-Myc表达;3.RNF8促进β-catenin的核异位;4.RNF8促进β-catenin的K63多聚泛素化;5.RNF8对结肠癌细胞的增殖是必需的。综述所述,我们得出以下结论RNF8通过K63连接的多聚泛素化促进β-catenin在结肠癌细胞中的核易位,进而上调其下游靶基因MYC的表达,从而促进结肠癌细胞的增殖。这些发现揭示了结肠癌发展的新机制,其可能是结肠癌治疗的潜在治疗靶标。