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栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）,又名瓜蒌、吊葫芦、药瓜,是一种多年生藤本植物,分布范围广,在我国的安徽、山东、江苏等地都有种植,是我国传统中药材。其果实、根、种子分别可作为栝楼、天花粉、栝楼籽入药,具有祛痰、降血糖、抗肿瘤等作用,可治疗咳嗽、胸痹心痛、便秘等病症。近年来,栝楼不仅作为药用植物,其新的药用价值、保健和食用价值也逐渐被发现。栝楼较高的药用和经济价值,使得栝楼的种植规模逐年扩大。栝楼角斑病最早报道于2003年,当时并未引起重视,随着种植面积的增大,病害也逐渐加重。本研究对栝楼角斑病的病原进行分离和鉴定,明确病原菌种类,对病原菌进行生理生化以及生长特性研究,同时基于REP-PCR方法对引起栝楼角斑病的致病菌与非致病菌的区分方法进行探讨,为栝楼角斑病的病原监测提供技术支持,并对栝楼角斑病的有效防治提供理论依据。主要研究结果如下:1、栝楼角斑病相关细菌的分离和鉴定本文在2019-2020年采用稀释涂布平板法分别对大别山地区的不同生态区采集栝楼角斑病病叶进行病原菌的分离,共获得280株菌株,分离获得细菌的菌落形态包括3种类型,其中Ⅰ型有231株菌株,菌落形态为黄色、圆形、表面凸起;Ⅱ型有16株菌株,菌落形态为白色、圆形、表面凸起;Ⅲ型有33株菌株,菌落形态为淡黄色、圆形、表面凸起。每种类型菌株选取代表性菌株进行16S rDNA片段扩增和序列分析,发现在Ⅰ型菌株中鞘氨醇单胞菌属占比达到86%,并有少量的微杆菌属、短小杆菌属等菌株也分离到;同时采集栝楼健康叶片和茎进行内生菌分离,共获得51株菌株,结果发现其中Ⅰ型菌株占比为9.8%,Ⅱ型菌株占比为41.1%,Ⅲ型菌株占比为39.2%,其他类型菌株5株。每种类型菌株选取代表性菌株进行16S rDNA片段扩增和序列分析,发现Ⅰ型菌株主要为短小杆菌属,并有微单胞菌属、土壤杆菌属的菌株也被分离到。进一步的,利用鞘氨醇单胞菌属的特异性引物对从病叶中分离的228株Ⅰ型菌株进特异性PCR检测,发现179株出现片段长度为500 bp的特异性条带,初步鉴定为鞘氨醇单胞菌属。选取不同来源的代表性菌株共21株,进行16S rDNA的序列分析和聚类分析,结果发现7株属于Sphingnomonas sanguinis,4株属于S.panni,1株属于S.azotifigens,1株属于S.zeae,1株属于S.yabuuchiae,1株属于S.carotinifaciens,有6株细菌单独聚成一个分支,推断可能是一个新种。2、致病性测定选取52株代表性菌株进行栝楼幼苗的致病性测定,用针刺法进行叶片的接种,发现分离出Ⅰ型菌株中的S.sanguinis、S.panni可以使叶片发病,发病症状与田间症状相似,而其他类型的菌株没有出现明显的发病症状。对接种发病的叶片进行再分离,获得的菌株与接种菌株菌落形态相似,经分子鉴定,确定引起栝楼细菌性角斑病的病原菌为S.sanguinis和S.panni。3、病原菌的生长特性研究测试了致病菌的生理生化以及生长特性,结果发现S.sanguinis（QS8、QS17、QS19）、S.panni（QS24、QS31）接触酶反应、吐温80水解、柠檬酸盐利用均为阳性,氧化酶、甲基红试验、吲哚试验均为阴性。同时研究发现测试的S.sanguinis菌株淀粉水解、乙酸氧化均为阳性,明胶液化阴性;而S.panni菌株的生理生化特性恰好相反。选取S.sanguinis QS17和S.panni QS24测试了不同温度、pH、盐浓度、抗生素对生长的影响。结果表明,它们的最适生长温度为28～32℃;酸碱耐受范围是5.5～8.5,在弱酸强碱环境下无法生存;盐浓度对菌株生长影响较大,当盐浓度高于5%时,菌株不生长;该两种菌株均不能在四环素的平板上生长,但均能在羧苄青霉素、卡那霉素、硫酸链霉素的平板上能生长。同时研究发现S.sanguinis QS17在氯霉素平板上不能生长,而S.panni QS24可以生长。4、栝楼角斑病相关细菌的分子鉴定前期研究发现,从栝楼病叶组织中分离获得的菌株呈现种类多样性,且目前大多数文献对鞘氨醇单胞菌属的分子鉴定方法仅采用16S rDNA的序列分析和聚类分析。为进一步更准确地鉴定鞘氨醇单胞菌属内种的水平,本研究基于已公布的鞘氨醇单胞菌参考菌株的基因组序列,针对16S-23S rDNA-ITS区域设计引物,对本研究分离菌株进行ITS片段扩增和序列分析。结果表明,采用16S rDNA与16S-23S rDNA-ITS两个位点进行多基因聚类分析,其系统发育树结果能对鞘氨醇单胞菌属的代表性种进行较好地区分,与前期16S rDNA聚类分析结果一致。同时本研究利用REP-PCR对栝楼角斑病致病菌与非致病菌进行基因组指纹图谱分析,结果发现,利用REP,BOX,ERIC对致病菌与非致病菌的基因组DNA进行PCR扩增和电泳,致病菌与非致病菌出现明显的差异性条带,同时发现致病菌的两个种S.sanguinis和S.panni之间,它们的指纹图谱也存在一定差异,研究结果为后期田间栝楼角斑病的病原检测提供了技术支撑。