【摘 要】
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背景:据现有文献研究显示低浓度的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及其受体之一的TNFR2均被证实可促进成骨前体细胞的成骨分化。此外,我们先前的研究显示,EphB4介导低浓度TNF-α的促成骨作用。然而,TNF-α在细胞诱导成骨分化的这一过程中,TNFR2和EphB4之间是否存在相互作用迄今为止尚无官方学术成果报道。在本研究中,我们用信号抑制策略来分析TNF-α诱导MC3T3-E1细胞成骨分化过程中T
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背景:据现有文献研究显示低浓度的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及其受体之一的TNFR2均被证实可促进成骨前体细胞的成骨分化。此外,我们先前的研究显示,EphB4介导低浓度TNF-α的促成骨作用。然而,TNF-α在细胞诱导成骨分化的这一过程中,TNFR2和EphB4之间是否存在相互作用迄今为止尚无官方学术成果报道。在本研究中,我们用信号抑制策略来分析TNF-α诱导MC3T3-E1细胞成骨分化过程中TNFR2和EphB4二者之间的作用关系,期望可以进一步明确TNF-α诱导成骨分化的机制。材料与方法:（1）经过低浓度TNF-α刺激后,MC3T3-E1细胞成骨相关标志物和TNFR2表达水平的变化细胞在添加了浓度为0.5 ng/ml的TNF-α的完全培养基或成骨诱导液中进行培养24 h或者48 h,应用qRT-PCR技术、Western blot技术、免疫荧光来检测TNFR2、RUNX2、BSP mRNA和蛋白的表达水平差异。ALP试剂盒检测ALP活性。（2）TNFR2和EphB4信号通路在TNF-α促进MC3T3-E1细胞成骨过程中的相互作用应用慢病毒感染细胞来建立TNFR2基因敲减的细胞;应用TNFR2中和抗体阻断TNFR2信号;或者使用NVP-BHG712抑制ephrinB2-EphB4正向信号,继续在含TNF-α的成骨诱导液中培养。应用qRT-PCR和Western blot检测RUNX2、BSP、TNFR2和EphB4的mRNA和蛋白表达水平。（3）低浓度的TNF-α激活的与EphB4/TNFR2相关的MAPK信号通路TNF-α刺激细胞0、5、15、30和60 min后检测MAPK通路相关蛋白表达水平。TNF-α刺激对照细胞、TNFR2敲减细胞、NVP-BHG712预处理细胞15分钟后,检测MAPK通路蛋白表达水平。细胞在常规培养基中培养,然后用ERK1/2抑制剂预处理60 min后,将培养基更换为添加TNF-α和相应抑制剂的成骨诱导液,检测RUNX2和BSP蛋白表达水平。结果:（1）低浓度的TNF-α可以促进MC3T3-E1细胞中成骨相关标志物及TNFR2的表达与对照组相比,TNF-α刺激细胞24 h、48h后,TNFR2、RUNX2和BSP mRNA和蛋白表达以及ALP活性明显升高。（2）阻断EphB4信号能够抑制TNF-α的促成骨分化作用,同时可以抑制TNFR2的表达;阻断TNFR2信号亦能抑制TNF-α的促成骨分化作用,但对TNF-α刺激的EphB4的表达无影响。与实验中的阴性对照细胞组进行比较,可见TNFR2敲减组的TNFR2 mRNA及蛋白表达水平都显著降低,低浓度TNF-α对TNFR2基因敲减细胞RUNX2、BSP蛋白表达的促进作用显著降低,但对EphB4蛋白表达的促进作用无影响。TNFR2中和抗体预处理后加入TNF-α,细胞内EphB4表达较单独应用TNF-α处理组无显著差异。NVP-BHG712预处理后加入TNF-α,与单独应用TNF-α处理组相比,TNFR2表达显著降低,TNF-α的促成骨分化作用被抑制。（3）ERK1/2是TNF-α激活的与EphB4/TNFR2相关的关键信号TNF-α明显增加了p-JNK1+2+3、p-ERK1/2 和p-p38 的水平。然而,只有p-ERK1/2的表达在TNFR2敲减的细胞中被明显抑制。NVP-BHG712处理MC3T3-E1细胞将EphB4正向信号抑制后,p-ERK1/2的表达明显下降。此外,ERK通路抑制剂U0126（10μM）明显逆转了 TNF-α对RUNX2和BSP蛋白水平的积极影响。结论:低浓度TNF-α通过激活一系列的信号网络来增强MC3T3-E1细胞成骨分化,EphB4、TNFR2和ERK/MAPK信号通路组成一个信号轴,介导TNF-α对MC3T3-E1细胞成骨分化的积极作用。
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