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土霉素(Oxytetracycline)是目前我国畜禽养殖业中较为常用的抗生素之一,易于随畜禽粪便排放至水体和土壤环境中,由此带来较为严重的环境污染。但目前国内外围绕环境中土霉素的生态毒理效应研究尚主要处在生物个体、组织和细胞水平上,所采用的毒理指标也主要适用于表征高污染状况下的毒性效应,而对于低污染水平下的毒理评价则显得无能为力。因此,细致表征土霉素的遗传毒理,建立更为精确和敏感的土霉素生态毒理指标和方法,将有助于土壤环境中土霉素的生态毒性的早期评价和诊断。
基于此,本论文以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为受试生物,以土霉素为目标污染物,采用荧光实时定量PCR技术(SYBR Green染料法),以,β-Action为内参基因,在mRNA表达水平上较为系统地研究了土霉素对赤子爱胜蚓超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、热休克蛋白(Hsp70)的基因表达情况的影响,得到以下初步结论:
(1)在土霉素的污染下,蚯蚓体内SOD、CAT、Hsp70的基因表达率均对其产生了不同程度的响应,但是不同基因对毒性响应的规律不同:SOD表达率基本呈现“先增加后减少”的响应趋势,且SOD表达率最高时间基本出现在2d(0.1、1、100、200 mg/kg最大表达率分别为2.732、0.025、38.586、26.63),而实验组10 mg/kg的表达率最高时间出现在28 d,表达率为5.938。CAT表达率基本呈现“先减少后增加”的响应趋势,且CAT表达率最高时间都出现在28 d(各处理组表达率最大值分别为0.747、1.912、2.092、4.469、1.899)。Hsp70表达率基本呈现“先增加后减少”的响应趋势,Hsp70表达率最高时间基本上在7d(1、10、100、200 mg/kg处理组的表达率最大值分别为8.056、8.398、6.612、5.579),而0.1 mg/kg处理组表达率最大值出现在14 d,为1.297。
(2)由SOD、CAT、Hsp70的表达率的时间响应趋势可得,在土霉素污染胁迫下,SOD和Hsp70首先被激发,CAT随后被激发,三者协同作用增强细胞的自我保护能力。
(3)三种基因的表达率的相关性分析表明,SOD和CAT(p=0.985)、SOD和Hsp70(p=0.059)、CAT和Hsp70(p=0.819)之间,p值均大于0.05,三者不存在明显相关性。
(4)通过方差分析发现,作用(染毒)时间的长短对SOD、CAT、Hsp70三种基因的表达率均有显著影响(p值分别为0.0600、0.0034、0.0011),而土霉素在实验浓度范围内对这三种基因的表达率影响均不显著(p值分别为0.2401、0.2327、0.2176)。
(5)在实际应用过程中,可考虑在不同时间段选择SOD,CAT,Hsp70的基因表达率作为生物标志物,以丰富和完善土霉素污染胁迫下的生态毒性效应评价和诊断指标体系。