目的:探讨小鼠体外Ⅰ型NKT细胞扩增培养体系的建立及体内实施α-GalCer负载的树突状细胞(α-GalCer-loaded DC)对小鼠NKT细胞的扩增活化效应。方法:C57BL/6小鼠脾细胞分别在含α-GalCer (100 ng/ml)、α-GalCer (100 ng/ml) + IL-2 (100 IU/ml)和α-GalCer (100 ng/ml) + IL-2 (100 IU/ml) + IL-7 (20 ng/ml)的体外扩增体系扩增培养。体内分2组分别注射α-GalCe(r2μg/mouse)和α-GalCer-loaded DC(1×106/mouse)扩增NKT细胞。采用α-GalCer-loaded CD1d tetramer和TCRβ单抗双标记流式细胞术检测NKT细胞比例,比较不同培养体系NKT细胞的扩增效率。免疫磁珠分选α-GalCer-loaded DC体内扩增的NKT细胞并进行纯度鉴定。ELISA法测定体内、体外扩增第7天小鼠血清、培养上清中的IL-4、IFNγ水平。结果:体外扩增培养第8天,α-GalCer、α-GalCer + IL-2、α-GalCer + IL-2 + IL-7三组NKT细胞比例分别为(8.70±1.97)%、(27.28±5.26)%、(51.25±7.80)%,α-GalCer + IL-2和α-GalCer + IL-2 + IL-7较α-GalCer具有显著的统计学意义的(P<0.01),α-GalCer + IL-2 + IL-7较α-GalCer + IL-2扩增比例显著增加(P=0.0327)。体内扩增体系中,α-GalCer组和α-GalCer-loaded DC组在C57BL/6小鼠脾细胞和胸腺细胞中,NKT细胞比例分别为:(15.46±2.63)%、(28.89±3.92)%;(38.41±3.91)%、(52.46±5.23)%。脾细胞中α-GalCer-loaded DC组较α-GalCer组具有明显的扩增效率(P=0.0315);胸腺细胞中,虽然α-GalCer-loaded DC组的扩增比例高于α-GalCer组,但无统计学意义(P>0.05)。免疫磁珠分选NKT细胞纯度高于90%。ELISA测定结果显示:α-GalCer-loaded DC较α-GalCer显著增加血清IL-4、IFNγ的分泌(P=0.0406,P=0.0129);α-GalCer + IL-2和α-GalCer + IL-2 + IL-7较α-GalCer明显增加培养上清中IL-4、IFNγ分泌,α-GalCer + IL-2 + IL-7和α-GalCer + IL-2比较无统计学意义(P>0.05)。结论:体外采用α-GalCer联合IL-2可有效扩增NKT细胞,加用IL-7可明显提高扩增效率。体内实施α-GalCer-loaded DC可显著扩增NKT细胞。体内外扩增活化的NKT细胞可分泌大量IL-4和IFNγ。目的:建立C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型。方法:25只SPF级BALB/c小鼠随机分为5组,各组小鼠分别接受7 Gy、7.5 Gy、8 Gy、8.5 Gy、9 Gy X射线全身照射(TBI)。20只BALB/c小鼠经预处理后随机分为4组,分别尾静脉输注1×106、2.5×106、5×106、10×106个骨髓细胞重建造血。在能重建造血的基础上建立aGVHD模型。为确定诱发不同程度aGVHD的脾细胞剂量,在输注骨髓细胞10×106基础上输注1×106、5×106、10×106个脾细胞,每个剂量组5只BALB/c小鼠。移植后观察aGVHD表现和生存率,2~3周取皮肤、肝脏、回肠进行病理组织学检查,3~4周进行嵌合度检测。结果:接受7 Gy剂量的小鼠,生存率为20%,中位生存期为22天;接受7.5 Gy、8 Gy、8.5 Gy、9 Gy剂量的小鼠全部死于造血衰竭,中位生存期分别为18、12、9、7天。四组生存时间采用Log-rank检验,χ2=18.85,P<0.0001。输注1×106、2.5×106骨髓细胞不能全部重建造血,60天生存率分别为40%和60%。输注5×106、10×106骨髓细胞可全部重建造血,60天生存率100%。四组生存时间采用Log-rank检验,χ2=6.78,P=0.0092。单纯输注骨髓细胞不能诱发aGVHD。低剂量脾细胞输注小鼠aGVHD程度轻,仅出现20% aGVHD相关死亡,中剂量和高剂量脾细胞输注小鼠均出现中重度aGVHD,一月内全部死亡(P<0.0001)。中重度aGVHD小鼠皮肤、肝脏和肠道可见明显的病理学改变。+28天脾细胞均达到完全供者嵌合体状态。结论: TBI 7.5 Gy以上对于BALB/c小鼠是致死性预处理。预处理后输注5×106以上骨髓细胞可全部重建造血。输注5×106以上脾细胞可诱发中重度aGVHD。确定8.5 Gy预处理,输注1×107骨髓细胞和5×106脾细胞建立清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型。目的:探讨α-GalCer-loaded DC输注移植小鼠以扩增活化宿主残存Ⅰ型NKT细胞,观察其对小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD的影响。另外,采用经α-GalCer-loaded DC体内扩增活化的宿主Ⅰ型NKT细胞输注,观察宿主NKT细胞过继免疫治疗对小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD的抑制效应。方法:在C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型中,分组如下:(1)α-GalCer和α-GalCer-loaded DC组:①BMT对照组:BMCs 1×107;②GVHD对照组:BMCs 1×107 + SCs 5×106;③α-GalCer组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer(2μg/mouse);④α-GalCer-loaded DC1组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer-loaded DC(1×105);⑤α-GalCer-loaded DC2组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer-loaded DC(5×105)⑥α-GalCer-loaded DC3组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer-loaded DC(1×106)。(2)宿主NKT细胞输注组:①BMT对照组:BMCs 1×107;②GVHD对照组:BMCs 1×107 + SCs 5×106;③宿主NKT细胞输注1组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(5×105);④宿主NKT细胞输注2组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(1×106)。移植后采用临床GVHD积分评价各组小鼠aGVHD严重程度;病理组织学检查评价皮肤、肝脏、小肠的病理损伤;Log-rank检验各组生存率;ELISA法测定移植后第7天小鼠血清中的IL-4、IL-10、IFNγ、TNFα和CCL8水平。此外,模拟allo-BMT可能出现的体内异基因反应建立体外混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察实施α-GalCer-loaded DC和宿主NKT细胞输注对异源性供者T淋巴细胞增殖效应的影响。以C57BL/6供鼠来源的脾细胞(H2b)作为反应细胞,以丝裂霉素C去增殖的α-GalCer-loaded DC体内刺激的BALB/c受鼠脾细胞(H2d)(SCs stimulated by DC)、未经α-GalCer-loaded DC刺激的BALB/c受鼠脾细胞(H2d)(SCs without stimulation)和宿主NKT细胞(Host NKT cells)、宿主NKT阴性T细胞(Host NKT- T cells)作为刺激细胞,在不同浓度梯度下3H掺入法检测H2b脾细胞(反应细胞)的增殖效应。结果:骨髓移植对照组BALB/c小鼠不出现GVHD表现。GVHD对照组小鼠出现中到重度的aGVHD表现。α-GalCer组、α-GalCer-loaded DC1(1×105)组、α-GalCer-loaded DC2(5×105)组、宿主NKT细胞输注(5×105)1组和宿主NKT细胞输注(1×106)2组临床GVHD评分均低于GVHD对照组(P<0.05),其中,以α-GalCer-loaded DC2(5×105)组和宿主NKT细胞输注(1×106)2组减低最为明显;α-GalCer-loaded DC3(1×106)组则出现与GVHD对照组相似或加重的GVHD表现。GVHD对照组小鼠出现明显的皮肤、肝脏和肠道病理改变。α-GalCer-loaded DC(5×105)组和宿主NKT细胞输注组(1×106)小鼠aGVHD靶器官病理改变较GVHD对照组轻。移植后观察100天,GVHD对照组和α-GalCer-loaded DC(31×106)组小鼠1月内全部死亡。α-GalCer组(28.6%,2/7)、α-GalCer-loaded DC1(1×105)组(16.7%,1/6)、α-GalCer-loaded DC2(5×105)组(50.0%;4/8)较对照组显著提高生存率(P<0.0001);α-GalCer-loaded DC2(5×105)组较α-GalCer组和α-GalCer-loaded DC1(1×105)组能明显改善生存率(P=0.0243,P=0.0097)。宿主NKT细胞输注(5×105)1组(28.6%,2/7)和宿主NKT细胞输注(1×106)2组(37.5%;3/8)较对照组显著提高生存率(P<0.0001);二者相互比较生存率无统计学意义(P>0.05)。ELISA测定细胞因子结果显示:α-GalCer组和α-GalCer-loaded DC(5×105)组较GVHD对照组显著增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001);α-GalCer-loaded DC(5×105)组IL-4的分泌较α-GalCer组明显增加(P=0.0176);IFNγ、TNFα在α-GalCer组、α-GalCer-loaded DC(5×105)组、GVHD对照组都呈现较高水平,无统计学意义(P>0.05);α-GalCer-loaded DC(1×106)组较α-GalCer-loaded DC(5×105)组IFNγ、TNFα分泌水平更高(P<0.05);宿主NKT细胞输注组(1×106)较GVHD对照组显著增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001),而IFNγ明显减少(P=0.0361);CCL8在各组都明显增加,无统计学意义(P>0.05)。混合淋巴细胞反应结果显示,SCs stimulated by DC较SCs without stimulation能显著抑制H2b脾细胞的增殖反应,且抑制强度呈剂量依赖性(P<0.05)。异源性宿主NKT细胞对H2b反应细胞的增殖有显著抑制作用,且抑制强度呈剂量依赖性,而宿主NKT阴性T细胞则无抑制效应(P<0.01)。结论:小鼠异基因骨髓移植后实施适宜剂量的α-GalCer loaded DC和宿主Ⅰ型NKT细胞输注能显著抑制GVHD的病理进程、明显改善生存率,其机制主要是通过α-GalCer loaded DC刺激宿主残存NKT细胞的活化,NKT细胞分泌大量Th2型细胞因子,并抑制异源性T淋巴细胞的增殖活化而共同发挥作用。目的:采用经α-GalCer-loaded DC体内扩增活化的供者Ⅰ型NKT细胞输注,探讨供者NKT细胞过继免疫治疗对小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD的免疫调控效应。方法:在C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型中,分组如下:①BMT对照组:BMCs 1×107;②GVHD对照组:BMCs 1×107 + SCs 5×106;③供者NKT细胞输注1组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(5×105);④供者NKT细胞输注2组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(1×106)。移植后采用临床GVHD积分评价各组小鼠aGVHD严重程度;病理组织学检查评价皮肤、肝脏、小肠的病理损伤;Log-rank检验各组生存率;ELISA法测定移植后第7天小鼠血清中的IL-4、IL-10、IFNγ、TNFα和CCL8水平。建立体外混合淋巴细胞反应(MLR)体系,以C57BL/6小鼠来源的脾细胞(H2b)作为反应细胞,以BALB/c小鼠来源的丝裂霉素C去增殖的脾细胞(H2d)作为刺激细胞,并在该MLR体系中加入不同数量的去增殖C57BL/6供鼠(H2b)来源的分选NKT细胞(Donor NKT cells)、NKT阴性T细胞(Donor NKT- T cells)。3H掺入法检测H2b脾细胞(反应细胞)的增殖效应。结果:骨髓移植对照组BALB/c小鼠不出现GVHD表现。GVHD对照组小鼠出现中到重度的GVHD表现。供者NKT细胞输注1组(5×105)和2组(1×106)GVHD临床评分低于GVHD对照组(P<0.05)。供者NKT细胞输注组(1×106)小鼠皮肤、肝脏和肠道病理改变较GVHD对照组减轻。移植后观察100天, GVHD对照组小鼠1月内全部死亡。供者NKT细胞输注1组(5×105)和2组(1×106)较GVHD对照组显著提高生存率(P<0.0001);供者NKT细胞输注2组(1×106)生存率(42.9%,3/7)高于NKT细胞输注1组(5×105)(25.0%,2/8)(P=0.0375)。ELISA测定细胞因子结果显示:供者NKT细胞输注组(1×106)较GVHD对照组显著增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001);IFNγ、TNFα、CCL8在供者NKT细胞输注组和GVHD对照组无统计学意义(P>0.05)。混合淋巴细胞反应结果显示,在加入2×105时,供者NKT细胞较NKT阴性T细胞对H2b反应细胞的增殖具有明显抑制作用(P=0.0382)结论:小鼠异基因骨髓移植后实施α-GalCer-loaded DC体内扩增活化的供者Ⅰ型NKT细胞输注可明显改善aGVHD的临床表现和病理改变、显著提高生存率,其机制主要是通过促进Th2型细胞因子的分泌和抑制供者T淋巴细胞的增殖活化而产生aGVHD抑制作用。目的:观察异基因造血干细胞移植患者Vα24+Vβ11+ NKT细胞的重建及移植物和外周血NKT细胞数量对aGVHD的影响。方法:2010年5月至2010年10月在苏州大学附属第一医院血液科接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的38例患者中,男性20例、女性18例,中位年龄3(313~55)岁。实施同胞全相合骨髓移植(MSD-BMT)患者20例,同胞全相合外周血干细胞移植(MSD-PBSCT)患者4例,无关供者全相合外周血干细胞移植(MUD-PBSCT)11例,单倍型骨髓移植(HID-BMT)3例。取骨髓和外周干细胞的移植物、移植患者+30、+60、+90天及aGVHD发生时的外周抗凝血,分离MNC以APC-CD3、PE-TCRVα24、FITC-TCRVβ11单抗进行三色标记,流式细胞术检测Vα24+Vβ11+ NKT细胞比例。分析发生aGVHD和未发生aGVHD患者的移植物和外周血NKT细胞数量对aGVHD的影响。结果:38例allo-HSCT患者均获得造血重建。aGVHD总发生率63%,其中Ⅰ~Ⅰ度50%,Ⅲ~Ⅲ度13%。+30、+60、+90天外周血NKT细胞比例分别为:BMT组(0.37±0.10)%、(0.34±0.09)%、(0.48±0.16)%,PBSCT组(0.33±0.07)%、(0.63±0.19)%、(0.55±0.15)%。PBSCT组在+60天明显高于BMT组(P=0.0462)。MSD-BMT中,发生aGVHD和未发生aGVHD患者输注NKT细胞数量和外周NKT细胞数量分别为(0.33±0.06)×106/kg、(0.40±0.10)×106/kg(P>0.05)和(0.9±0.18)×106/L、(1.1±0.25)×106/L(P>0.05)。MUD-PBSCT中,发生aGVHD和未发生aGVHD患者输注NKT细胞数量和外周NKT细胞数量分别为(0.29±0.07)×106/kg、(0.26±0.09)×106/kg(P>0.05)和(1.2±0.24)×106/L、(1.0±0.21)×106/L(P>0.05)。表明移植物和外周血中NKT细胞的绝对数量不影响aGVHD的发生和程度。结论:异基因造血干细胞移植患者NKT细胞的重建骨髓移植慢于外周血干细胞移植,输注NKT细胞数量和外周血NKT细胞数量不影响aGVHD的发生和严重程度。