【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种主要以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病,给养猪业带来了巨大的经济损失。本研究以2006年
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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种主要以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病,给养猪业带来了巨大的经济损失。本研究以2006年夏季以来我国南方部分地区陆续发生的高致病性PRRS疫情为背景,用流行的PRRSV湖南株为亲本毒株构建全长感染性cDNA克隆,为实现在DNA水平上对PRRSV基因组进行人工操作和研究PRRSV的复制和致病机理、基因功能等提供技术手段,并为构建新型病毒载体和发展安全有效的疫苗搭建平台。根据已发表的高致病性PRRSV毒株全基因组序列及酶切位点分布,将病毒基因组分9段设计特异性引物,预期扩增覆盖全基因组的重叠cDNA片段为173、174、175、176、177、177p、178、179和215,其大小分别为486bp、2437bp、2059bp、2718bp、2406bp、1450bp、3306bp、2249bp和645bp;同时在序列5’端起始位点引入T7 RNA聚合酶启动子序列和3’端引入含30个A的poly(A)尾及单一线性化酶切位点。首先通过优化的RT-PCR反应体系扩增出目的cDNA片段,并将它们分别克隆入pMD18-T载体进行序列测定和比对分析,获取序列完全正确的cDNA克隆;然后将9个cDNA片段按构建策略进行亚克隆,在2个高拷贝质粒载体pMCS1.1和pMCS2.1的基础上构建4个高拷贝重组质粒A、B1N、B2、C,并将A、B1N、B2、C依次亚克隆到低拷贝质粒pAC1.1中,最终获得含全长cDNA克隆的重组质粒pAC-HPPRRS-F。按低拷贝质粒提取方法大量制备含全长cDNA克隆的重组质粒pAC-HPPRRS-F,随机选取病毒基因组中的5组酶切位点,用限制性内切酶进行酶切鉴定。然后将pAC-HPPRRS-F用MluⅠ线性化后作为模板进行RNA体外转录,经脂质体Lipofectin Reagent转染Marc-145细胞以获得体外拯救病毒。转染48h后取细胞上清接种Marc-145细胞进行传代培养,盲传至第3代时产生了明显的细胞病变,经RT-PCR和免疫组织化学染色检测证实获得了PRRSV,结果表明该研究构初步建出了PRRSV湖南株全长感染性cDNA克隆。
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