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种质资源是育种工作的物质基础,是基因的储存库,种质资源积累了由自然和人工引起的极其丰富的遗传变异,蕴藏着各种性状的遗传基因,是生物多样性的重要组成部分,从多个层次对种质资源评价鉴别,发掘和开发利用与所期待的目标相一致的基因,是当前育种工作的核心任务之一。
百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)所有植物的总称,为世界著名的观赏花卉,适合于盆栽,鲜切花和庭院绿化,还具有较高的食用药用价值,在国内外市场上占有重要地位。百合种质资源收集、评价和利用及其种质创新历来为国内外所重视,我国有着丰富的百合资源,但在百合种质创新方面十分薄弱,很少有较高观赏价值的商业品种问世。引进花卉育种技术先进的国家的优良百合种质资源并对其评价鉴定,通过栽培品种种质资源多样性状况的了解和评比,可以了解其优良品种遗传背景,各品种间的亲缘关系、生理差异,从而初步了解国际现有观赏百合种质资源多样性状况,引进和补充新优良基因资源,为国内百合新品种的研发工作建立基础和提供指导。
本研究对49个荷兰进口优良百合品种从株高,地径,叶宽,叶长等表型性状进行了表型多样性评价,同时利用AFLP分子标记技术,对优良百合品种的遗传多样性状况、亲缘关系以及育种背景进行了评价和分析,主要的研究结果如下:
1.通过对各百合品种的叶长、叶宽、叶长/叶宽、地径、株高5个表型性状的变异系数分析、变异水平方差分析、主成分分析,表明49个百合品种在这些表型性状上均存在着不同幅度的变异,且差异均达到显著水平,表型性状之间的差异主要表现为高生长的变异,其次是叶片形状的不同。
2.以百合5个表型性状指数为参数,采用最大距离法进行百合49个品种的聚类分析。结果表明,49个百合品种能够被所观测表型性状完全区分开,说明所调查的表型性状能够反映出各品种间存在明显差异,且品种之间的遗传变异丰富。在遗传距离的阈值为2.5时,49个百合品种被区分为2大类,第一大类为29个品种,分为7个品种群,第二大类为20个品种,分为两个品种群
3.针对百合叶片中多糖、蛋白质以及色素类等物质含量较高的特点,采用改良的CTAB法和SDS法从百合叶片中提取DNA,并进行效果比较,筛选出适于百合AFLP分析的基因组DNA最有效的提取方法。结果表明:在样品研磨过程中加入少量PVP,DNA提取液中加入2%CTAB,4μLβ-巯基乙醇和200μL5mol/LKac,重复冰无水乙醇沉淀,75%酒精多次洗涤,所提取百合的基因组DNA纯度高、基本无降解,适于AFLP分析要求。
4.确定了百合AFLP分析过程中的最佳DNA模板浓度,最佳Mg2+浓度,最佳dNTP浓度,最佳Taq聚合酶浓度,最佳引物浓度,建立了适合百合AFLP技术的最佳反应体系,完成了DNA的酶切和连接预扩增、选择性扩增等试验过程,利用EcoRI和PstI进行双酶切,从64对EcoRI/PstI引物中筛选出6对清晰、多态性高的引物,对48个不同品种百合样本进行了AFLP分析,都得到了清晰的指纹图谱,并且表现出较好的多态性。6对引物共扩增出459个可统计标记,其中多态性标记406个,多态带百分率为88.5%,平均每对引物扩增76.5条带。多态性片段长度主要分布在120-900bp的范围内。多态性最高的为引物组合P59/E34,高达91.7%,最低的是P45/E42,多态性为85.5%。运用Popgene3.2软件计算出各位点不同品种的频率分布,得到48个样本总的遗传多样性为h=0.2570,Shannon信息指数I=0.3993。揭示了48个百合品种具有丰富的遗传多样性,其遗传背景较复杂,品种问存在丰富的变异。
5.对指纹图谱进行判读,构建0、1矩阵。利用POPGENE1.32软件计算遗传多样性指数,基于Nei’s遗传距离采用UPGMA法进行聚类分析。根据AFLP聚类分析结果把48个百合品种分为2大类群,第一大类包括3个品种,第二大类包括45个品种,进一步可划分为12个亚群。
6.表型性状和AFLP分子标记的多样性分析评价均表明49个百合品种间存在丰富的变异。根据百合品种的表型与AFLP的聚类关系比较分析,共有19个品种的聚类关系在表型聚类与AFLP聚类中存在差异,30个品种在表型聚类和AFLP聚类中均处于同一分支,其中有13个品种的聚类关系在两种聚类中完全一致。说明形态标记与分子标记分析相互结合,相互补充可以对百合品种资源做出更科学、更合理、更准确地评价。