论文部分内容阅读
紫杉醇(Paclitaxel, PTX)和阿霉素(doxorubicin, DOX)是最具代表性的两种化疗药物,因其特有的药物作用机制,它们被广泛应用于多种实体瘤的联合化疗中。然而,应用游离体形式联合化疗仍存在肿瘤抑制率低、毒副反应重、易诱发多药耐药的弊端。同时,PTX与DOX都具有难溶于水的性质,从而导致药物配置过程繁琐、药物输注过程复杂。纳米脂质体载药系统(nanostructured lipid carrier, NLC)制备技术成熟、药物性能稳定,现有的抗肿瘤药物纳米脂质体展现出较好的药物稳定性、较好的药物控释能力、较轻的药物毒副反应等优点,因此,纳米脂质体是制备二者共载系统的理想载体。本研究通过熔融乳化技术,首次成功制备PTX-DOX共载纳米脂质体；在体外检测了该脂质体对人非小细胞肺癌细胞株NCL-H460的抑瘤能力；并通过构建的NCL-H460荷瘤裸鼠模型,评价了PTX、DOX共载纳米脂质体的体内抗癌效果。第一部分PTX-DOX共载纳米脂质体的制备研究目的：纳米脂质体的组成和结构使其具有广泛的药物包容性,从小分子化学药物到生物大分子都可以通过脂质体来控制释放。药物经脂质体包封后,其动力学发生了很大的变化,药物在血液循环中的半衰期延长,药物的毒副反应降低,药物溶解性得到了提高。纳米脂质体的结构与生物膜的结构相同,可以通过多种途径进入血液循环,可以增加药物制剂的靶向性,能够减少治疗剂量。本部分研究旨在建立一种两药联合共载纳米脂质体,共同载药PTX和DOX。这种药物共载体系,最大化的发挥联合化疗的优点,最小化减轻联合化疗的缺点,解决单独用药易出现的多药耐药性问题,特异性靶向杀伤肿瘤细胞,减轻对正常细胞和组织的损伤。研究方法：本研究采用熔融乳化技术制备PTX-DOX共载纳米脂质体。纳米粒径分析仪分析其粒径、粒径分布、表面电荷数及多分散指数(polydispersity index, PDI),采用紫外分光光度法于480 nm处分析微球中DOX的含量,采用高效液相色谱法分析微球中PTX含量；采用透析法测定PTX-DOX共载纳米脂质体的体外释药特征。研究结果：本研究中制备的纳米脂质体经过测定,空白NLC及载药NLC的粒径均介于125-130 nm之间,PDI值为0.18,表明所制备的脂质体具有良好的分散性。Zata电位+27 mV说明PTX-DOX-NLC稳定性较高,NLC易靶向转运至癌细胞。PTX-DOX-NLC的载药量与载药率相比于PTX-NLC、DOX-NLC均有轻微下降,但下降幅度不大。结合粒径及Zata电位的实验结果,说明即使载药量与载药率轻微下降,但该纳米脂质体的稳定性未受影响。PTX-DOX-NLC体外释药过程符合Higuchi线性方程,药物释放呈现持续而缓慢的释放,PTX以及DOX在24h内释放率可达70%以上。对比PTX-DOX-NLC、PTX-NLC和DOX-NLC三种纳米脂质体药物体外释放曲线,发现三者药物释放速率基本相当,PTX-DOX-NLC中PTX和DOX都于48 h内缓慢释放,表明PTX-DOX-NLC具有缓释PTX和DOX的能力。研究结论：本研究通过熔融乳化技术成功制备共同载有PTX-DOX的纳米脂质体,空白NLC及载药NLC的粒径均介于125-130nm之间,说明包封PTX与DOX并未影响纳米脂质体的粒径。PTX-DOX-NLC的载药量与载药率相比于PTX-NLC、DOX-NLC有轻微下降,但该纳米脂质体的稳定性未受影响。PTX-DOX-NLC体外释药过程符合Higuchi线性方程,PTX-DOX-NLC具有缓释PTX和DOX的能力。第二部分PTX-DOX-NLC的体外抗肿瘤活性研究研究目的：药物对人癌细胞的破坏作用即细胞毒性试验,细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的细胞杀伤事件,它不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行,最常用的方法是MTT比色法。本部分研究利用MTT比色法检测细胞增殖抑制率,经统计学分析,实际评价PTX-DOX-NLC对人非小细胞肺癌细胞株NCL-H460的抗肿瘤活性。研究方法：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法,其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法被常规应用于细胞毒性试验。它的特点是灵敏度高、经济。本研究中应用MTT法检测细胞增殖抑制率,采用统计软件SPSS 17.0处理数据,计算IC50,对比不同浓度药物下细胞增殖抑制率,探索药物作用模式、最佳剂量和细胞毒性。同样方法测定PTX/DOX不同比例联合载药的PTX-DOX-NLC抑制肿瘤细胞增殖活性,从而筛选最佳的联合载药比例。研究结果：用载药NLC或游离药物处理48h的NCL-H460细胞,其存活率呈剂量依赖性降低,且以脂质体形式联合给药PTX-DOX对人非小细胞肺癌细胞的抑制效果最佳。与其他比例相比,PTX-DOX-NLC中的PTX/DOX值为1/1时,IC50最低,因此可确定为最佳比例。脂质体给药的细胞毒性要大于游离形式,约为其2-3倍,而PTX-DOX-NLC的细胞毒性更强,高于载单一药物NLC(3倍)及游离药物(9倍)(P<0.05)。研究结论：采用MTT法测定细胞存活率,对比PTX-DOX-NLC、PTX-NLC、 DOX-NLC.游离PTX、游离DOX不同浓度处理NCL-H460,结果表明用载药NLC或游离药物处理48h的NCL-H460细胞,其存活率呈剂量依赖性降低,且以脂质体形式联合给药PTX-DOX对人非小细胞肺癌细胞的抑制效果最佳。本研究以抑制细胞增殖活性IC50为参数,采用不同的联合载药比例,从而筛选出了最佳的联合载药比例：PTX-DOX-NLC中的PTX/DOX值为1/1时,IC50最低,因此确定1/1为最佳比例。PTX-DOX-NLC的细胞毒性高于载单一药物NLC及游离药物(P<0.05),说明PTX-DOX-NLC抗肿瘤作用靶向性最明确。第三部分PTX-DOX-NLC对NCL-H460荷瘤裸鼠的抗肿瘤研究研究目的：SPF级BALB/c (5-6周龄,体重约为18-22 g)裸鼠被广泛应用于肿瘤学、免疫学、毒理学等基础医学和临床医学的研究。通过建立人非小细胞肺癌株NCL-H460荷瘤裸鼠模型,比较联合载药纳米脂质体与游离药物的体内抑瘤效果。研究方法：皮下注射法建立NCL-H460荷瘤裸鼠模型,动态观察裸鼠肿瘤生长及食欲活动变化等情况。绘制连续给药21天肿瘤生长曲线；对比不同给药形式肿瘤生长抑制率。实验数据采用mean±SD表示,采用SPSS 17.0统计分析软件对所得样本进行统计分析。首先进行正态分布检验,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05差异具有统计学意义。研究结果：NLC制剂组的抑瘤效果显著优于游离药物组。PTX-DOX-NLC具有最高抑瘤率为84%,其次DOX-NLC抑瘤率为65%,PTX-NLC抑瘤率为64%,游离DOX和PTX抑瘤率为26%。PTX-DOX-NLC、PTX-NLC、DOX-NLC均可显著抑制肿瘤的生长(P<0.05),且PTX-DOX-NLC效果最好。给予NLC制剂处理的三组小鼠,体重均未有明显的变化,但游离药物给药组及阴性对照组小鼠均出现了体重的明显下降,并伴随进食量减少、活动量减少。研究结论：对NCL-H460荷瘤裸鼠模型分组注射PTX-DOX-NLC,PTX-NLC, DOX-NLC,游离PTX,游离DOX和0.9%生理盐水(NS),得到肿瘤生长曲线。实验结果表明PTX-DOX-NLC,PTX-NLC和DOX-NLC制剂均可显著抑制肿瘤的生长(P<0.05),且PTX-DOX-NLC效果最好。NLC制剂组的抑瘤效果显著优于游离药物组。对不同给药组进行肿瘤抑制率的分析,结果为PTX-DOX-NLC具有最高抑瘤率为84%,其次为DOX-NLC 65%, PTX-NLC 64%,游离DOX和PTX抑瘤率为26%。因PTX和DOX两种药物具有协同效应,PTX-DOX-NLC具有最好的抑瘤效果,且毒副反应最轻。